PrimeSTARによるPCR産物をTAクローニング
製品説明
PrimeSTARシリーズなどのα型DNAポリメラーゼにより増幅されたPCR産物のほとんどは、酵素自身がもつ強力な3’→5’exonuclease活性により平滑末端となっており、そのままではTAクローニングに使用できない。PrimeSTARシリーズによる増幅産物をTAクローニングに用いる場合には、3’末端にdAを付加する必要がある。
本製品には、PrimeSTARシリーズによる、増幅産物の3’末端に簡便にdAを付加するためのA-overhang mixture、およびMighty TA-cloning Kitが含まれており、PrimeSTARシリーズによる増幅産物専用のTAクローニング用試薬として使用することができる。
PrimeSTARシリーズの基本的な特長
本製品には、PrimeSTARシリーズによる、増幅産物の3’末端に簡便にdAを付加するためのA-overhang mixture、およびMighty TA-cloning Kitが含まれており、PrimeSTARシリーズによる増幅産物専用のTAクローニング用試薬として使用することができる。
PrimeSTARシリーズの基本的な特長
内容
（本製品は、Mighty TA-cloning KitとA-overhang mixtureのセット品です。）
（20回分）
（20回分）
| A. Mighty TA-cloning Kit（製品コード 6028） | |
| 1. pMD20-T vector (50 ng/μl) | 20 μl |
| 2. Ligation Mighty Mix ＊1 | 50 μl×2 |
| 3. Positive Control Insert ＊2 | 10 μl |
| B. A-overhang mixture（製品コード R029）＊3 | |
| 1. A-overhang enzyme | 10 μl |
| 2. 10×Buffer | 20 μl |
| 3. dATP | 10 μl |
| *1 | Ligation Mighty MixはDNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞（製品コード 6023）と同じものです。 |
| *2 | 3’-末端に dAオーバーハングを有する約 200 bpのDNAフラグメント（E. coliゲノムDNAを鋳型として、TaKaRa Ex Taqで増幅したもの) (10 ng /μl) |
| *3 | A-Overhang mixture（製品コード R029）の単品販売は行っておりません。 |
保存
－20℃
キット以外に必要な試薬（主なもの）
- コンピテントセルまたはエレクトロセル（E. coli）
- SOC細菌培養培地
- アンピシリン、X-Gal、IPTGを添加したLBプレート
ベクターマップ
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| 図1. pMD20-Tのベクターマップ |
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| 図2. pMD20-Tクローニングサイト |
ベクターのDNAシーケンスデータ
ZIP形式で圧縮しておりますが、StuffIt Expander等でも解凍できます。
使用上の注意
- Ligation Mighty Mixは氷中で溶解し、穏やかに撹拌してから使用してください。
- クローニングするフラグメントによっては、挿入されるフラグメントの長さや向きにより停止コドンの出現やフレームシフトが起こらず、カラーセレクションプレート上で淡青色のコロニーとなることがあります。このような場合、コロニーPCRを行ってインサートを確認することをお勧めします。
- アガロースゲルから目的の増幅フラグメントを回収する場合、UVの照射に注意してください。長い時間照射されるとDNAがダメージを受け、クローニングの効率が低下します。
- PCRの鋳型にクローニングベクターと同一の選択マーカー(pMD20-T vectorの場合は Ampr)を有するプラスミドを用いる場合は、鋳型プラスミドそのものを保持する形質転換コロニーの出現を防ぐため、PCR 反応液を電気泳動後、アガロースゲルから目的バンドを回収・精製して本操作に使用することをお勧めします。
クローニング選択ガイド＆実験オンラインツール
クローニング操作の基本フロー
クローニング実験ハンドブック
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