クリプトスポリジウム属の検出
製品説明
クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）は胞子虫類に属する原虫で、環境中では「オーシスト」と呼ばれる嚢包（のうほう）体の形（大きさは4～6 μm）で存在し、ヒトや動物（ウシ、ブタ、ネコ、イヌなど）の消化管の細胞に寄生することにより増殖し、激しい下痢症状を呈します。感染性を持ったオ－シストが糞便中に大量に排出され、それにより汚染された食品や飲料水を介してヒトに経口感染します。オ－シストは、水中では冷蔵で数ヵ月程度の生存が可能であり、塩素に対してもきわめて強い耐性があります。わが国では、クリプトスポリジウム感染症は5類感染症に分類され、厚生労働省は「水道におけるクリプトスポリジウム等対策指針」を策定し、原水の安全性確認としてクリプトスポリジウム等および指標菌の検査が行われています。クリプトスポリジウムは人工培地で培養できないことから、検出方法として、蛍光顕微鏡により蛍光抗体染色したオーシストを観察する方法で原虫の確認が行われているが、高度な技術と経験が必要とされています。
本製品は、クリプトスポリジウム18S rRNA遺伝子をターゲットとして、ゲノムDNA上の遺伝子に加え、クリプトスポリジウム由来RNAを逆転写したcDNAも検出します。ゲノムDNAに対してRNAはコピー数が多いことが知られており、RNAを対象としたリアルタイムPCR法（リアルタイムRT-PCR法）により、微量のクリプトスポリジウムを検出できます。リアルタイムPCR法は、簡便性、迅速性、反応特異性の高さから、近年、環境衛生管理において急速に普及しています。クリプトスポリジウム感染症への対策においても、有効活用されることが期待されています。
本製品の増幅反応には、Hot Start PCR用酵素のTaKaRa Ex Taq Hot Start Versionを使用しており、反応液調製時などサイクル前のミスプライミングやプライマーダイマーに由来する非特異的増幅を抑制しながら高感度の検出が可能です。増幅産物の検出にはサイクリングプローブ法を採用しています。この方法はRNAとDNAからなるキメラプローブとRNase Hの組み合わせによる高感度な検出方法で、非常に特異性の高い検出が可能です。
本製品には、クリプトスポリジウム18S rRNA遺伝子を検出するためのFAM標識プローブ、インターナルコントロールDNAとインターナルコントロール検出用のROX標識プローブが含まれており、二波長を同時にモニタリングすることで、1本のチューブでクリプトスポリジウム遺伝子の検出とインターナルコントロールDNAの検出による偽陰性の確認試験が可能です。
Crypto. Positive Control を用いて検量線を作成することで、サンプル中に含まれるクリプトスポリジウムの定量も可能です。
本製品は、クリプトスポリジウム18S rRNA遺伝子をターゲットとして、ゲノムDNA上の遺伝子に加え、クリプトスポリジウム由来RNAを逆転写したcDNAも検出します。ゲノムDNAに対してRNAはコピー数が多いことが知られており、RNAを対象としたリアルタイムPCR法（リアルタイムRT-PCR法）により、微量のクリプトスポリジウムを検出できます。リアルタイムPCR法は、簡便性、迅速性、反応特異性の高さから、近年、環境衛生管理において急速に普及しています。クリプトスポリジウム感染症への対策においても、有効活用されることが期待されています。
本製品の増幅反応には、Hot Start PCR用酵素のTaKaRa Ex Taq Hot Start Versionを使用しており、反応液調製時などサイクル前のミスプライミングやプライマーダイマーに由来する非特異的増幅を抑制しながら高感度の検出が可能です。増幅産物の検出にはサイクリングプローブ法を採用しています。この方法はRNAとDNAからなるキメラプローブとRNase Hの組み合わせによる高感度な検出方法で、非常に特異性の高い検出が可能です。
本製品には、クリプトスポリジウム18S rRNA遺伝子を検出するためのFAM標識プローブ、インターナルコントロールDNAとインターナルコントロール検出用のROX標識プローブが含まれており、二波長を同時にモニタリングすることで、1本のチューブでクリプトスポリジウム遺伝子の検出とインターナルコントロールDNAの検出による偽陰性の確認試験が可能です。
Crypto. Positive Control を用いて検量線を作成することで、サンプル中に含まれるクリプトスポリジウムの定量も可能です。
厚生労働省健康局水道課長通知「健水発0302第2～4号」（平成24年3月2日発付）「水道に関するクリプトスポリジウム等の検出のための検査方法の見直し等について」に遺伝子検出法が収載されました。
詳しくはこちらをご覧ください。内容
（50回分、25 μl反応系）
*1 蛍光標識プローブを含んでいるので、遮光すること。
*2 リアルタイムPCRコンポーネント（1～4）に誤って混入すると、正しい検出反応を行うことができなくなる。
開封後は、リアルタイムPCRコンポーネント（1～4）を付属のキットケースに移し、別に保存すること。
| ● | 1. | 5×PrimeScript RT Master Mix | 5×conc. | 100 μl |
|---|---|---|---|---|
| ● | 2. | 2×Cycleave Reaction Mixture | 2×conc. | 625 μl |
| ● | 3. | Crypto. Primer/Probe Mix（FAM, ROX）*1 | 5×conc. | 250 μl |
| ○ | 4. | RNase Free dH2O | 1 ml | |
| ● | 5. | Lysis Buffer | 625 μl×4 | |
| ○ | 6. | Proteinase K | 20 mg/ml | 50 μl |
| ○ | 7. | dH2O（for Dilution） | 150 μl | |
| ● | 8. | Crypto. Positive Control*2 | 1×105 copies/μl | 50 μl |
| ● | 9. | EASY Dilution (for Real Time PCR) | 1 ml×2 | |
*1 蛍光標識プローブを含んでいるので、遮光すること。
*2 リアルタイムPCRコンポーネント（1～4）に誤って混入すると、正しい検出反応を行うことができなくなる。
開封後は、リアルタイムPCRコンポーネント（1～4）を付属のキットケースに移し、別に保存すること。
保存
－20℃
本製品以外に必要な機器、器具、試薬（主なもの）
- 【機器】
- リアルタイムPCR装置および専用チューブ
- Thermal Cycler Dice Real Time System IV with PC（製品コード TP1010）
- Thermal Cycler Dice Real Time System III with PC（製品コード TP970）*3
- Thermal Cycler Dice Real Time System II（製品コード TP900/TP960：終売）*3
- Thermal Cycler Dice Real Time System Lite（製品コード TP700/TP760：終売）*3
食品環境検査用ソフトウェア・Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）など
または、Thermal Cycler Dice Real Time System Software -
*3 チューブ1本ごとにフラットキャップが付いているキャップ付き0.1 mlまたは0.2 ml 8連チューブをThermal Cycler Dice Real Time System専用として販売している。チューブ間のコンタミネーションリスクを軽減できる。
0.1 ml 8-strip tube, individual Flat Caps（製品コード NJ902）：TP970用
0.2 ml 8-strip tube, individual Flat Caps（製品コード NJ600）：TP900/TP960/TP700/TP760用（対象機種は全て終売）
- 【その他】
- 200 μl、20 μl、10 μl 各マイクロピペット
- マイクロピペット用チップ（疎水性フィルター付）
- 卓上遠心器
検出可能な種
本製品で使用しているCrypto. Primer/Probe Mixの配列情報からは、以下の菌種が検出可能である。
- Cryptosporidium parvum (C. parvum)
- C. hominis
- C. meleagridis
- C. canis
- C. felis
- C. muris
- C. andersoni
- C. baileyi
- C. bovis
- C. wrairi
補足資料
Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズ「食品環境検査用ソフトウェア」を使用の場合に便利な“Quick Manual”を用意している。
キットに添付の取扱説明書とあわせて使用する。
CycleavePCRキットによる定性解析（PDF、989 K） 定量解析（絶対定量モード）用（PDF、993 K） リアルタイムPCRによるクリプトスポリジウム、ジアルジア検出（PDF、1.12 MB）
キットに添付の取扱説明書とあわせて使用する。
CycleavePCRキットによる定性解析（PDF、989 K） 定量解析（絶対定量モード）用（PDF、993 K） リアルタイムPCRによるクリプトスポリジウム、ジアルジア検出（PDF、1.12 MB）
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- 注意事項
- 本製品は食品分析および環境分析用試薬です。ヒト、動物への医療、臨床診断には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。検査結果判定により発生する問題に関してタカラバイオ株式会社は一切の責任を負いません。
- タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。
- タカラバイオ製品に関連するライセンス・パテントについては、ライセンスマークをクリックして内容をご確認ください。
また、他メーカーの製品に関するライセンス・パテントについては、各メーカーのウェブサイトまたはメーカー発行のカタログ等でご確認ください。 - ウェブサイトに掲載している会社名および商品名などは、各社の商号、または登録済みもしくは未登録の商標であり、これらは各所有者に帰属します。
