食中毒菌関連遺伝子をインターカレーター法によるリアルタイムPCRで迅速に検出
【重要なお知らせ】
弊社リアルタイムPCR装置「Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズ」において弊社遺伝子検査キットを使用する場合の解析条件を変更いたしました。
変更の詳細はこちら
取扱説明書およびその他製品に付随する文書は、順次更新予定です。
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製品説明
本製品は、主な食中毒病原菌および下痢性病原菌を、インターカレーター法によりリアルタイムPCRで検出するためのプライマーシリーズである。特定の菌または病原因子の遺伝子の極めて特異的な配列部分に相補するよう設計されたリアルタイムPCR専用のプライマーで、Thermal Cycler Dice Real Time System II（製品コード TP900/TP850：終売）等のリアルタイムPCR装置を使用し、TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR420S/A/B）＊と組み合わせて反応を行う。得られた増幅曲線のCt値および融解曲線のパターンとTm値から、専用の陽性コントロールDNAでの反応結果と照らし合わせて判定を行う。
TB Greenによるインターカレーター法のリアルタイムPCR検出は、蛍光プローブを準備する必要がなく、2×濃度のプレミックス試薬であるTB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)に、Primer MixとサンプルDNAを添加するだけで、非常に簡便・迅速に病原性因子または菌の遺伝子検出が行え、従来行っていた電気泳動も不要である。
また、本プライマーシリーズはすべて同一のPCR条件で反応を行うことができるため、複数のプライマーによる反応を同時に実施でき、一度に複数種の検出が可能である。
TB Greenによるインターカレーター法のリアルタイムPCR検出は、蛍光プローブを準備する必要がなく、2×濃度のプレミックス試薬であるTB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)に、Primer MixとサンプルDNAを添加するだけで、非常に簡便・迅速に病原性因子または菌の遺伝子検出が行え、従来行っていた電気泳動も不要である。
また、本プライマーシリーズはすべて同一のPCR条件で反応を行うことができるため、複数のプライマーによる反応を同時に実施でき、一度に複数種の検出が可能である。
本製品は、岐阜大学大学院 医学系研究科病原体制御学分野 教授 江崎孝行先生のご協力のもとに開発いたしました。
＜注意＞- 本プライマーシリーズは、TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR420S/A/B）と組み合わせて使用するように 判定基準を設定しています。他の試薬を用いた場合、正確な判定ができませんので、必ずTB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)と 組み合わせてご使用ください。
- PCR反応は、QuickPrimerの取扱説明書に記載の条件で実施してください。
- 各Primerでの標準的な増幅曲線および融解曲線のパターンは、それぞれのデータシートをご確認ください。
Tm値自動判定ツールのエクセルシートを以下よりダウンロードしていただけます。説明書をお読みいただき、ご利用ください。
・QuickPrimer 結果判定用エクセルシート（ZIP、315 K）
・QuickPrimer結果判定用エクセルシート説明書（PDF、858 K）
（注）
「QuickPrimer結果判定用エクセルシート」は、Microsoft Office Excelで作成されたマクロを含むファイルです。
Excelのセキュリティがアクティブな場合、マクロを含むブックを開くたびに実際にウイルスに感染していなくても注意を促すメッセージが表示されます。「マクロを有効にする」を選択してファイルをご利用ください。
・QuickPrimer 結果判定用エクセルシート（ZIP、315 K）
・QuickPrimer結果判定用エクセルシート説明書（PDF、858 K）
（注）
「QuickPrimer結果判定用エクセルシート」は、Microsoft Office Excelで作成されたマクロを含むファイルです。
Excelのセキュリティがアクティブな場合、マクロを含むブックを開くたびに実際にウイルスに感染していなくても注意を促すメッセージが表示されます。「マクロを有効にする」を選択してファイルをご利用ください。
内容
（20 μl反応系、100回）
Primer Mix（5×）（各2 μM） 400 μl
Primer Mix（5×）（各2 μM） 400 μl
保存
－20℃
本製品以外に必要な試薬および機器など（主なもの）
- 【試薬】
- TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR420S/A/B）*
滅菌精製水（RNase-free Water（製品コード 9012）など）＊ 本プライマーシリーズは、TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR420S/A/B） と組み合わせて使用するように判定基準を設定しています。他の試薬を用いた場合、正確な判定ができませんので、 必ずTB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)と組み合わせてご使用ください。
- 【陽性コントロールDNA】
- QuickPrimer (Real Time) シリーズ用Positive Control DNA 全9種類*（製品コード MR401/MR403～MR406/MR408～MR410/MR415）
* 各陽性コントロールDNAは、滅菌精製水を用いて10倍希釈し、陽性コントロール反応に使用してください。
希釈用滅菌水には、RNase-free Water（製品コード 9012）をご利用いただくと便利です。 - 【機器】
- リアルタイム PCR装置
Thermal Cycler Dice Real Time System III（製品コード TP950/TP970/TP980/TP990）
Thermal Cycler Dice Real Time System II（製品コード TP900/TP960：終売）
Thermal Cycler Dice Real Time System Lite（製品コード TP700/TP760：終売）
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）
Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）など - 【機器専用反応チューブ】
-
Thermal Cycler Dice Real Time System III を使用する場合
0.1 ml 8-strip tube, individual Flat Caps（製品コード NJ902）
Thermal Cycler Dice Real Time System IIおよびLite（終売） を使用する場合
0.2 ml 8-strip tube, individual Flat Caps（製品コード NJ600）など - 【その他】
-
200 μl、20 μl、10 μl 各マイクロピペット
マイクロピペット用チップ（疎水性フィルター付）
卓上遠心機
操作上の注意
- 反応液の調製から検体サンプルの添加まで、次の3つのエリアを設定し、物理的に隔離することを推奨する。各エリアにおいては、増幅産物の入ったチューブの開閉は避ける。
○エリア1：反応液の調製、分注を行う。
○エリア2：検体の調製を行う。
○エリア3：反応液へ検体の添加を行う。
本製品では増幅反応と検出をリアルタイムで行うため、反応終了後の増幅産物を電気泳動などで解析する必要はない。実験室内の核酸のコンタミネーション発生の原因となるので、増幅産物をチューブから取り出さないこと。 - リアルタイムPCR装置の各種Auto機能が適正に働かなかった場合は、誤判定の原因になる。必要に応じてリアルタイムPCR装置の取扱説明書に従い、Manual設定を行う。
操作の概要
- サンプルの調製
- リアルタイムPCR装置のセッティング
- 反応液の調製と反応開始
反応液を調製
↓
反応液を反応チューブに分注
↓
陰性コントロール（滅菌精製水）、またはサンプル、または陽性コントロールDNA（10倍希釈液：用時調製）を添加
↓
反応チューブをリアルタイムPCR装置にセットし反応を開始
↓ 画面上にリアルタイムに増幅曲線を表示 - 反応終了
融解曲線分析によりTm値を求める - 得られたCt値、Tm値およびピークの波形をもとに結果を判定
使用に際して
- 本製品は遺伝子検出であるため、不活化された細菌も検出し、生菌のみを検出対象とするものではありません。また、設計したPrimerの配列内に遺伝子の変異や欠損／挿入が生じた際には、検出できない場合があります。（検査結果判定により発生する問題に関して、タカラバイオ株式会社は一切の責任を負いません。）
- 判定の確定には遺伝子検査だけではなく、培養検査などの結果も併用の上、ご判断ください。
補足資料
Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズ「食品環境検査用ソフトウェア」を使用の場合に便利な“Quick Manual”を用意している。
キットに添付の取扱説明書とあわせて使用する。
QuickPrimerシリーズ用（PDF、1.26 M）
キットに添付の取扱説明書とあわせて使用する。
QuickPrimerシリーズ用（PDF、1.26 M）
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- 注意事項
- 本製品は食品分析および環境分析用試薬です。ヒト、動物への医療、臨床診断には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。検査結果判定により発生する問題に関してタカラバイオ株式会社は一切の責任を負いません。
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