pCold™ベクターシリーズ

大腸菌宿主としてBL21株を用い、以下の手順で共発現実験を行った。

1. 共発現系の構築

1. シャペロンプラスミドpG-Tf2でBL21 Competent Cellsを形質転換する（クロラムフェニコールで選択）。
2. 形質転換体（BL21/pG-Tf2）を液体培養し、コンピテントセルを調製する。
3. 目的遺伝子を挿入したpCold I DNAでBL21/pG-Tf2株を形質転換する（クロラムフェニコールとアンピシリンで選択）。
4. 共発現大腸菌を得る。^*
* pG-TF2で既に形質転換済みの大腸菌BL21コンピテントセルも発売しています。
（製品コード 9124：Chaperone Competent Cells pG-TF2/BL21）

2. 共発現実験

1. pCold I DNAとpG-Tf2の共発現大腸菌を、プラスミド選択薬剤（クロラムフェニコールとアンピシリン）およびシャペロン発現誘導用薬剤（1 ng/mlテトラサイクリン）を含むL培地で、37℃で培養する。
2. OD₆₀₀ = 0.4～0.5付近で、培養液を15℃に冷却し、30分間放置する。
3. 培養液に0.5 mM IPTGを添加し、15℃でさらに24時間振とう培養する。
4. 集菌、破砕し、SDS-PAGEにより、全タンパク質画分、可溶性画分における目的タンパク質の発現量を確認する。

なお、比較のために行ったpCold I DNAのみでの発現実験では、目的遺伝子を含むpCold I DNAで形質転換したBL21株を、アンピシリンを含むL培地でOD₆₀₀ = 0.4～0.5付近まで培養し、培養液を15℃で30分間放置後、培養液に0.5 mM IPTGを添加してさらに15℃で24時間振とう培養した。

ヒト遺伝子A（推定分子量70 kDa）は、pCold I DNA単独の発現系ではほとんどすべてが不溶性発現となったが、シャペロンプラスミドpG-Tf2を共発現させた系では、可溶性画分の発現量が顕著に増加した（図1）。

　図1. pG-Tf2による可溶化促進の例

ヒト遺伝子B（推定分子量24 kDa）は、pCold I DNA単独の発現系ではほとんど発現が認められなかったが、シャペロンプラスミドpG-Tf2との共発現を行うことで、目的タンパク質の発現が確認されただけでなく、そのほとんどが可溶化していた（図2）。

　図2. 発現・可溶化の成功例