BcaBEST^® Labeling Kit

1．マイクロチューブ（エッペンドルフ型、ポリプロピレン製）に下記の反応液^*2を調製する。95℃で3分間加熱した後、氷中で急冷し5分間放置する。

鋳型DNA＊1	25 ng
Random Primer	2 μl
滅菌精製水（またはTE Buffer）	5 μlにfill up ＊2

2．10×Buffer、dNTP Mixtureを各2.5 μl、標識dCTP^＊3（50 μCi）を5 μl加えて、滅菌精製水で24 μlにfill upする。

〈Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2の場合〉

3．Exo-free Klenow Fragment 1 μlを加え、37℃で10分間^＊4保温する。

4．65℃で5分間加熱し、酵素を失活させる（またはEDTAを最終濃度が30 mMになるように加える）。

〈BcaBEST Labeling Kitの場合〉

3．BcaBEST DNA Polymerase 1 μlを加え、50～55℃で10分間^＊4保温する。

4．EDTAを最終濃度が30 mMになるように加える。

5．95℃で3分間加熱した後、氷中で急冷する。

6．そのまま適量をハイブリダイゼーションプローブ液として用いる必要ならば（NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（製品コード 740609.10/.50/.250）、ゲルろ過あるいはエタノール沈殿で未反応の標識dCTPを除去する）。

＊1	このキットは、鋳型DNAを25 ng用いることを標準としているが、10 ng～1 μgの範囲ではこの手順にしたがって反応が行える。 また、アガロースを除かずに低融点アガロースゲル中のDNAを反応に使用することも可能である（このとき、アガロースにはPrimeGel Agarose LMT 1-20K GAT（製品コード 5806A）やPrimeGel Agarose LMT PCR-Sieve GAT（製品コード 5815A）が適している）。 手順は次の通りである。 （1）アガロースゲル電気泳動を行い、目的とする断片を含むアガロースゲル片を切り出す。 （2）ゲル片の重量の3倍量の滅菌精製水を加える。 （3）65℃でアガロースを溶解させる。 （4）DNA25 ng分の溶液を、そのまま鋳型DNAとして反応に用いる。
＊2	鋳型DNAの溶液濃度が低い場合には、14 μlまでscale upできる。その場合は、TE Bufferでfill upする。
＊3	このキットは、〔α-32P〕dCTP（111 TBq/mmol、3,000 Ci/mmol）を用いて標識するように組み立てられているが、〔α-35S〕または〔3H〕標識のdCTPも同様に使用できる。 比活性の異なる標識のdCTPを使用する場合は、反応液中の濃度が変化しないように標識dCTPの量を調節する。 また、放射性dATPを用いて標識を行うときには、dNTP MixtureとしてdGTP、dCTP、dTTP各0.2 mMの溶液を用いる。
＊4	反応時間は、10分間で充分高い比活性を持つプローブが得られる。またオーバーナイト反応においても、取り込み率の低下はごくわずかである。

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Protocol
取り込み率・比活性の測定
1．反応液の少量をTE Bufferまたは滅菌精製水で20倍に希釈する。
2．希釈した反応液3 μlをDE81 paper disc（Whatman社製）2枚にスポットして、風乾する。
3．2. のDE81 discのうちの1枚を、5％Na₂HPO₄ 100 ml程度で5分間ずつ6回、さらに滅菌精製水で1分間ずつ2回、エタノールで2回洗浄し風乾する。
4．2. の未洗浄のDE81 discと3で洗浄したDE81 discのそれぞれを、液体シンチレーションカウンターで測定する。
5．次の式により、取り込み率、プローブの比活性を求める。

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Note
鋳型DNA量の変化によるプローブ比活性の変動
1．Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2

2．BcaBEST Labeling Kit

※λ-Hind III 断片を〔α-³²P〕dCTP（111 TBq/mmol、3,000 Ci/mmol）1.85 MBq（50 μCi）を用いてラベルした場合