TaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA Taq、Pyrobest DNA Polymeraseについて
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＜Pyrobest DNA Polymerase＞
Q1 Pyrobest DNA Polymeraseの正確性（Fidelity）はTaq Polymeraseよりどれくらい上がっていますか？
A1 Clineらの方法、Kunkelらの方法などを用いての検討では、 Taq Polymerase (TaKaRa Taq)と比較して約10倍正確性が上昇しています。
Q2 Pyrobest DNA Polymeraseで増幅可能な鎖長はどれくらい？
A2 弊社でのデータではヒトゲノムの約6 kbの増幅とλDNAの約12 kbの増幅に成功しています。
25～30 merのプライマーを用いて、シャトルPCR（2ステップPCR)で増幅することで、良い結果が得られることが多いです。
25～30 merのプライマーを用いて、シャトルPCR（2ステップPCR)で増幅することで、良い結果が得られることが多いです。
Q3 Pyrobestを用いて増幅したPCR産物の末端の形状はどうなっていますか？
A3 多くは平滑末端になっています。PCR産物はそのまま平滑末端のベクターにサブクローニングするか、あるいはリン酸化して脱リン酸化した平滑末端のベクターにサブクローニングすることをお勧めします。
＜TaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA Taq＞
Q4 TaKaRa Ex TaqとTaKaRa LA Taqの違いは？
A4 TaKaRa Ex TaqはタカラバイオのスタンダードPCR酵素で、反応性・増幅効率・感度が非常に高く、ゲノムDNAを鋳型にした場合でも20 kb程度まで増幅が可能です。TaKaRa LA Taqは、長鎖増幅用に最適化されたPCR酵素です。λDNAが鋳型の場合、40 kbを超える増幅も可能であり、ゲノムDNAを鋳型にした場合でも、30 kbの増幅が行えることを確認しています。
Q5 TaKaRa Ex TaqとTaKaRa LA Taqの正確性（Fidelity）は？
A5 これらの酵素は3'→5'exonuclease活性を持つため、通常のTaKaRa Taqより正確性が高いと考えられます。Kunkel法を用いた検討では、TaKaRa Taqと比較して、TaKaRa Ex Taqで約3倍、TaKaRa LA Taqで約5倍、Fidelityが高いという実験結果が得られています。
しかしながら、PCRでの正確性は増幅するターゲットやPCR条件によっても大きく変動します。特に増幅効率が良いTaKaRa Ex TaqやTaKaRa LA Taqで正確性を求める反応を行う場合には、使用する鋳型量をスメアしない範囲で増やし、サイクル数を抑えた(22～25サイクル）反応系を組むことをお勧めします。
しかしながら、PCRでの正確性は増幅するターゲットやPCR条件によっても大きく変動します。特に増幅効率が良いTaKaRa Ex TaqやTaKaRa LA Taqで正確性を求める反応を行う場合には、使用する鋳型量をスメアしない範囲で増やし、サイクル数を抑えた(22～25サイクル）反応系を組むことをお勧めします。
Q6 TaKaRa LA Taq with GC Bufferのバッファーの使い分けは？
A6 GC Buffer IとIIは組成を公表していませんが、GC Buffer IよりもIIの方がDNAの変性効果が強いバッファーです。したがって、まず最初にGC Buffer Iをお試しいただくことをお勧めしています。 GC Buffer Iで増幅できない場合にIIをお試しください。
Q7 LA Taq with GC BufferはLong PCRができるのですか？
A7 LA TaqはLong PCR用の酵素であるのでもちろん可能です。GC含量50％の鋳型の場合、GC Buffer Iを用いてヒトゲノムの17.5 kbの増幅とλDNAの35 kbの増幅が可能です。また、GC含量の高い(GC 約70％)鋳型に対しては、少なくとも約2 kbの増幅を確認しています。
Q8 LA Taq with GC Bufferを使ってGC含量の高い鋳型に挑戦したい。何か注意点は？
A8 通常のPCRを行うときよりもプライマーのTm値の高いものをお勧めします。したがって、長さは25～30 merのものをご使用ください。プライマーの3'末端の配列が大切で、GCが高くならないようにし、また、上流・下流プライマーの配列が3'末端で相補しないように設計してください。
Q9 LA Taq with GC Bufferで、GC richなテンプレートを用いた場合に増幅できるサイズは？
A9 高GC含量（約70％）の鋳型の場合で2 kbの増幅を確認しています(GC Buffer I使用）。数百bpの短鎖の増幅も、もちろん可能です。
Q10 LA Taq with GC Bufferに添付されているGC Bufferで、GC richでないテンプレートの増幅もできるか？
A10 GC Buffer Iを用いた、GC含量約50％のテンプレートの増幅実験で、ヒトゲノムの17.5 kbの増幅と、λDNAの35 kbの増幅を確認していますので、GC richでないテンプレートの増幅も可能です。ただし、GC Bufferは、通常のLA PCR Bufferよりも高い変性効果を持っているため、GC含量の少ないテンプレートに用いた場合は、増幅効率が下がる場合があります（特にGC Buffer IIを用いた場合）。GC含量が50％前後のテンプレートの増幅には、通常のLA Taqに添付されているLA PCR Buffer IIの使用をお勧めします。
Q11 PCRで、イノシン（dITP）が含まれているプライマーは使用できるか？
A11 3'→5'exonuclease活性をもつTaq（TaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA Taq、TaKaRa Z-Taq、Pyrobest DNA Polymerase）を用いた場合、イノシンが含まれたプライマーを使用すると、反応性が著しく低下します。プライマーにイノシンが含まれている場合は、TaKaRa Taq（製品コード R001A/B/C）をご使用ください。
