核酸抽出・精製

A1　
菌体のペレットが十分に懸濁されていない。

• 菌体ペレットをBuffer A1で完全に懸濁することが重要です。Buffer A2を加える前に細胞のかたまりが無いことを確認してください。

Buffer A2中にSDSが沈殿している。

• Buffer A2の保存中にSDSが沈殿する場合があります。沈殿が生じた場合はBuffer A2を30～40℃で5分間インキュベートし、SDSが溶けるまでよく混合してください。使用前には室温まで戻してください。

使用している菌体の量が多すぎる。

• 最適な培地として、LB培地の使用をお勧めします。
  TB（terrific broth）培地のような高栄養培地を使用する場合、培地中の菌体濃度が高くなりすぎることがあります。

Buffer A2の混合が不十分である。

• Buffer A2を加えた後は、着色が一様になっていることを確認してください。ムラがある場合、混合が不十分である可能性があります。

A2　
菌体の溶解が不完全である。

• 「Q1.菌体が完全に溶解しない。」を参照してください。

培養中、抗生物質を使用しなかった、または使用量が不十分であった。

• 抗生物質の使用量が不適切である場合、目的のプラスミドを保持する細胞よりも、形質転換していない細胞が増殖する可能性があります。全ての培地に、新しく調製した抗生物質のストック溶液を適切な量加えてください。

培養時間が長すぎる。

• 37℃で16時間以上振盪培養しないでください。培地は、LB培地を推奨します。TB(terrific broth)培地のような高栄養培地を使用する場合は、培養時間は12時間未満にしてください。

中和が不十分である。

• Buffer A3を加えた後は、LyseControlの青色が無色になるまでチューブを反転して穏やかに混合し、完全に中和したことを確認してください。

溶出条件が最適でない。

• 溶出にはBuffer AE（5 mM Tris-HCl, pH8.5）などの弱アルカリ性溶出バッファーを使用してください。
  滅菌水など、Buffer AE以外の溶液で溶出している場合は、溶出液のpHを確認してください。pH7未満では、バッファーの溶出能が低下します。

プラスミドが高コピーでない。

• NucleoSpin Plasmidの場合：低コピー数プラスミド（例えばP15A oriのプラスミド、コスミド、P1コンストラクトなど）を使用している場合、使用する培養液量は少なくとも5 mlまで増量してください。

A3　
試薬の調製が適切でない。

• Buffer A4（concentrate）またはBuffer AQ（concentrate）は、使用前に96～100％エタノールをプロトコールに記載の量を加え、十分に混和して使用してください。

高いヌクレアーゼ活性をもつ宿主菌を使用している。

• 高いヌクレアーゼ活性を持つ宿主菌を使用する場合は特に、DNA分解を防ぐために調製したプラスミドは凍結状態で保存してください。
• NucleoSpin Plasmidの場合：高いヌクレアーゼ活性を持つ宿主菌（ABLE、HB101、またはJM110など）を使用する場合は、Buffer A4での洗浄ステップの前に、追加でBuffer AWによる洗浄操作を必ず行ってください。
  その場合、あらかじめ50℃に温めたBuffer AW 500 μlを添加し、11,000×gで1分間遠心しますが、カラムにBuffer AWを添加後、2分間おいてから遠心すると効果的です。

調製したプラスミドDNAの保存方法が不適切である。

• プラスミドは調製後、アガロースゲル電気泳動などを行い、すぐに定量してください。
  滅菌水に溶解したプラスミドDNAは－18℃以下で保存、またAEバッファーまたはTEバッファーに溶解したプラスミドDNAは5℃以下で保存してください。

A4　
プラスミドDNAにニックがある。

• Buffer A2を加えた後、5分以上インキュベートしないでください。

ゲノムDNAが混入している。

• Buffer A2を加えた後、ボルテックスまたは激しく混和しないでください。
  ゲノムDNAが剪断を受け、上清に多量に混入します。

アガロースゲルで泳動するとプラスミドのバンドがスメアになる。

• 高いヌクレアーゼ活性を持つ宿主菌株を使用する場合は特に、DNAの分解を防ぐために、調製したDNAは凍結状態で保存してください。
• NucleoSpin Plasmidの場合：高いヌクレアーゼ活性を持つ宿主菌を使用する場合は、Buffer A4での洗浄ステップの前に、追加でBuffer AWによる洗浄操作を必ず行ってください。
  その場合、あらかじめ50℃に温めたBuffer AW 500 μlを添加し、11,000×gで1分間遠心しますが、カラムにBuffer AWを添加後、2分間おいてから遠心すると効果的です。

A5　
エタノールの持ち込み

• NucleoSpin Plasmidの場合：エタノールを含むBuffer A4を完全に除去するため、ステップ6において11,000×gで必ず2分間遠心操作をしてください。
• NucleoSpin Plasmid EasyPureの場合：エタノールを含むBuffer AQを完全に除去するため、ステップ5において12,000×gで1分間遠心後、カラムが乾いていない場合は別のチューブにカラムをセットして遠心を繰り返します。遠心後のカラムを37℃で10～15分間インキュベートして完全にカラムを乾燥させるとより効果的です。

プラスミドDNAの溶出をTE Bufferで行った。

• EDTAはシーケンス反応を阻害する場合があります。プラスミドDNAを再精製しBuffer AEまたは滅菌水で溶出してください。あるいは、溶出したDNAをエタノール沈殿後、Buffer AEまたは減菌水に再溶解してください。

Buffer AWによる追加の洗浄操作を実施していない。

• NucleoSpin Plasmidの場合：Buffer A4による洗浄の前にBuffer AW 500 μlを用いて追加の洗浄を行うと、シーケンス反応における解読長が増加します。

シーケンス反応に十分なDNA量を使用していない。

• シーケンス反応に使用する前に、アガロースゲル電気泳動によりDNAを定量してください。

プラスミドDNAの調製に用いた大腸菌菌体量が多すぎる

• 蛍光DNAシーケンスに用いるプラスミドDNAを調製する場合は、定常期まで培養した大腸菌の培養液を3 ml以上使用しないでください。

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