目的遺伝子を搭載したpLVSINレンチウイルスベクタープラスミドの構築
Lentiviral High Titer Packaging Mix（製品コード 6194）
- プラスミドDNAを増幅する場合には、大腸菌宿主株、例えばE. coli HST08 Premium Electro-Cells（製品コード 9028）などに導入し、市販のプラスミド精製キットを用いて精製する。
- 標準的なクローニング技術を用いて、目的の遺伝子コード配列をpLVSINレンチウイルスベクタープラスミドのマルチクローニングサイト（MCS）に挿入する。また、In-Fusion HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer（製品コード 639634など）も使用できる。このキットを用いると、PCR 産物をどのような直鎖状ベクターにも容易にクローニングできる。
注 目的遺伝子配列（cDNAあるいは遺伝子断片）はATG開始コドンと終始コドンを含む配列で挿入する。Kozak consensus ribosome binding site（Kozak, 1987）を付加すると発現レベルが向上する可能性がある。一方、遺伝子断片あるいはcDNAにポリAシグナルは不要である。このような配列をウイルスLTR間に挿入すると、ウイルスゲノムの転写過程で未成熟の分解とポリA化が起こり、機能的な組換えビリオン（ウイルス粒子）の産生が妨げられることがある（Coffin et al .,1997）。 - パッケージング細胞のトランスフェクションに適したグレードのプラスミドDNA調製を行う。
（参考） NucleoBond Xtra Midi/Maxi（製品コード 740410.10、740414.10など）の使用を推奨する。また、同キットを用いた場合でも、取得したプラスミドDNAを14,000×gで10分間遠心し、その上清をプラスミドDNA溶液として回収することで、トランスフェクションに適した、さらに高純度のプラスミドDNA溶液の取得が可能である。
