レンチウイルスベクターによる遺伝子導入 ＜製品選択ガイド＞

・qRT-PCR

Lenti-X qRT-PCR Titration Kit（製品コード 631235）を用いれば、インターカレーター法の1ステップqRT-PCRで上清中のRNAタイターを迅速に約4時間で測定することができる。この方法は、マーカーに関係なく、どのようなレンチウイルスベクターにも使用でき、種々のベクターの力価比較や、回収したばかりのウイルスストック液の力価測定に有用である。

・p24 ELISA

Lenti-X p24 Rapid Titer Kit（製品コード 632200）はELISA法を用いてウイルス上清中のp24キャプシドタンパク質の量を測定する。p24の量はウイルス力価と相関する。本アッセイの所要時間は約4時間である。

・フローサイトメトリー

蛍光タンパク質搭載のレンチウイルスベクターの場合、フローサイトメトリーにより蛍光値を測定することで、導入効率を測定することができる。
（B. フローサイトメーターを用いた生物学的力価測定法参照。）

・抗生物質選択

選択マーカーを含むレンチウイルスベクターの場合、ウイルスストック液の段階希釈系列を作製してそれぞれを細胞に感染させ、適切な抗生物質を用いて安定な遺伝子導入細胞を選択する。選択終了後に増殖する薬剤耐性コロニーの数から力価を計算する。

B-1．HT-1080細胞播種

HT-1080細胞を12ウェル細胞培養用プレートに2.5×10⁴ cells/1 ml/wellで播種し、5％ CO₂インキュベーター内で37℃にて培養する。
培地は10％ FBS含有DMEM 培地を使用する。1％ Penicillin-Streptomycinを添加したDMEM培地も使用できる。

B-2．レンチウイルス感染（細胞播種翌日）

1．10％ FBS含有DMEM培地にポリブレンを添加する。（培地450 μlに対して8 mg/mlポリブレン溶液0.5 μl）
2．B-1.にて播種したHT-1080細胞の培地を450 μlのポリブレン含有培地と交換する。
3．調製したレンチウイルス液を10％ FBS含有DMEMで段階希釈する。希釈倍率はウイルス力価にもよるが、20～2,000倍での段階希釈が望ましい。
4．希釈したレンチウイルス液50 μlを2.のHT-1080細胞に滴下し、感染させる。（ポリブレン終濃度：8 μg/ml、ウイルス最終希釈倍率：200～20,000倍）
5．5％ CO₂インキュベーター内で37℃にて一晩培養する。

B-3．培地交換

1．翌日にウイルス含有培地を1 mlの10％ FBS 含有DMEMに交換する。
2．5％ CO₂インキュベーター内で37℃にて二晩培養する。

B-4．フローサイトメーターで評価

翌々日（感染から3日後）、細胞をTrypsin/EDTAで剥がして回収し、フローサイトメーターにてAcGFP1陽性率を測定する。

B-5．Viral biological titerの算出

得られたAcGFP1 陽性率を以下の式に当てはめて生物学的力価（IFU/ml）を算出する。計算に使用するAcGFP1陽性率は1.0～20.0％が望ましい。

Titer（IFU/ml）＝感染細胞数×AcGFP1陽性率（％）／100×ウイルス希釈倍率／感染時液量（0.5 ml）