レンチウイルスベクターを用いたヒトiPS細胞への遺伝子導入とシングルセルクローニング
Lentiviral High Titer Packaging Mix（製品コード 6194）により得られる組換えレンチウイルス液は、通常濃縮することなく直接標的細胞への感染に使用できる。ヒトiPS/ES細胞をフィーダーフリー条件下でシングルセル培養可能なCellartis DEF-CS 500 Culture System（製品コード Y30010）を用いて培養したヒトiPS細胞に組換えレンチウイルス液で遺伝子導入し、iPS細胞クローンを効率良く選択した結果を示す。
【材料と方法】
- 細胞培養
- ヒトiPS細胞株（253G1）及び、Cellartis human iPS cell line 12 (ChiPSC12)（製品コード Y00285）を、あらかじめCellartis DEF-CS 500 Culture System（製品コード Y30010）の標準プロトコールで前培養し、培地に馴らした後、実験に供した。
- レンチウイルスベクターの調製
- pLVSIN-EF1α-AcGFP1-N1 Vector（製品コード 6189）とLentiviral High Titer Packaging Mix（製品コード 6194）を製品プロトコールに従ってLenti-X 293T Cell Line（製品コード 632180）にコトランスフェクションして、培養上清中にAcGFP1発現レンチウイルスベクターを産生した。培養上清を0.45 μmフィルターで濾過して細胞屑を除いたものをウイルス液として、小分け分注後、凍結保存した。通常、107 IFU/mL以上の高力価ウイルス液を取得できる。
- レンチウイルスベクターを用いたヒトiPS細胞への遺伝子導入
- [Day 0]
あらかじめDEF-CS COAT-1でコートした12ウェルプレートに、各iPS細胞を6×104 cells/well、1 ml/well DEF-CS培地（GF-1、2、3添加）の条件で播種した。各々の細胞について2プレート準備し、一晩培養した。
[Day 1]
各ウェルに終濃度8 μg/mlとなるようにポリブレン溶液を添加後、各ウイルス液量を細胞に添加した（表1参照）。1枚の12ウェルプレートは37℃、5％ CO2インキュベーターに静置し、もう1枚は遠心処理（32℃、1,200×g、60分間）した後に37℃、5％ CO2インキュベーターに静置した。4時間後に新鮮なDEF-CS培地（GF-1、2添加）に全量交換し（1 ml/well）、培養を続けた。
表1. ウイルス液添加量[Day 3]希釈倍率 1：11 1：33 1：100 1：300 1：900 1：2,700 添加量（/ml） 90 μl 30 μl 10 μl 3.3 μl 1.1 μl 0.37 μl
感染開始から48時間後に、再度新鮮なDEF-CS培地（GF-1、2添加）に全量交換し（1 ml/well）、培養を継続した。
[Day 4]
感染開始から72時間後の細胞を回収し、フローサイトメーターでAcGFP1発現細胞を計測した（図1）。 - シングルセルクローニング
- AcGFP1発現ユニットを染色体に1コピー持つiPS細胞株の樹立のため、以下のクローニング作業を実施した。ウイルス感染から72時間後、AcGFP1陽性率が20％以下の細胞集団を新たな培養容器に継代し、0.5 μg/ml Puromycinによる導入細胞の薬剤選択をおこなった。Puromycin耐性となった細胞集団をTrypLE Selectにてシングルセル分散した後、6ウェルプレートに100 cells/wellで播種した。GF-1、2、3を添加したDEF-CS培地を使用し、2、4、6日後に培地交換を行い、AcGFP1発現iPS株を単離した（図2. A）
【結果】
図1. レンチウイルスベクターを用いたヒトiPS細胞への遺伝子導入
レンチウイルスにより、2種のiPS細胞（A. 253G1株、B. ChiPSC12株）に高効率でAcGFP1遺伝子を導入できた。さらに遠心処理を追加することで感染効率は27倍以上向上した。
（A）実験概要を示す。AcGFP1陽性率が20％以下の感染条件（遠心処理無し、1：100～1：2700）で得られた細胞をPuromycinで薬剤選択することで主に1コピーが挿入された細胞集団を作製後、6ウェルプレートにウェルあたり100個の細胞を播種し、翌日から細胞観察を実施、クローン候補を選択した。
（B）選択クローンが、シングルセルから増殖していく様子を継時的に示す。
結論
Cellartis DEF-CS 500 Culture Systemを用いてシングルセル継代したiPS細胞は、レンチウイルスベクターにより高効率で遺伝子導入可能なことがわかりました。また導入細胞を希釈倍率を上げて分散することで、独立した１細胞から遺伝子導入クローンを容易に樹立することができました。
