ZsGreen1発現293Tクローン細胞を用いたRNPでのゲノム編集
【実験の流れ】
【方法】
試薬の準備
Cas9タンパク質：Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl)（製品コード 632641）
sgRNA：Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit（製品コード 632635）によりZsGreen1遺伝子に対するsgRNAを調製
遺伝子導入試薬：TransIT-X2（製品コード MIR6003）またはA社遺伝子導入製品。
1日目：細胞の準備
ZsGreen1発現293Tクローン細胞 （ZsGreen1を1 copy/cell保持）（293T-ZsGreen1細胞）を3.5×105 cells/mlに調製し、0.5 mlずつ24 well plateへ播種した。
2日目：RNPの細胞への導入
4日目：細胞の継代
9日目：Flow cytometryによるノックアウト効率（ゲノム編集効率）の解析
ZsGreen1陰性細胞率（ノックアウト効率）をFlow cytometryを用いて解析した。
Cas9タンパク質：Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl)（製品コード 632641）
sgRNA：Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit（製品コード 632635）によりZsGreen1遺伝子に対するsgRNAを調製
遺伝子導入試薬：TransIT-X2（製品コード MIR6003）またはA社遺伝子導入製品。
1日目：細胞の準備
ZsGreen1発現293Tクローン細胞 （ZsGreen1を1 copy/cell保持）（293T-ZsGreen1細胞）を3.5×105 cells/mlに調製し、0.5 mlずつ24 well plateへ播種した。
2日目：RNPの細胞への導入
1．TransIT-X2 (24 well plate)の場合
製品protocolに準じて実施
- Opti-MEM I Reduced Serum Media 50 μlにCas9タンパク質とsgRNAを加えピペッティングした後、37℃で5分間インキュベート
- TransIT-X2を1 μl添加してピペッティング
- 室温で15～30分間インキュベート
- 細胞へ添加
製品protocolに準じて実施
4日目：細胞の継代
9日目：Flow cytometryによるノックアウト効率（ゲノム編集効率）の解析
ZsGreen1陰性細胞率（ノックアウト効率）をFlow cytometryを用いて解析した。
【結果】
293T-ZsGreen1細胞のZsGreen1ノックアウト効率を評価した。その結果、TransIT-X2では、BおよびC条件で50％以上のノックアウト効率が認められ、A社製品を用いた場合と比較して高いノックアウト効率を示した。NTは無処理の細胞を示す。（図1）
（弊社取得データ）
図1. 293T-ZsGreen1細胞でのA社製品とのノックアウト効率の比較
