RNA-Seq解析/SMART-Seq解析

RNA-Seq解析/SMART-Seq解析 Q&A

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<解析手法に関する疑問>

Q1 RNA-Seq解析とSMART-Seq解析の違いは何ですか?
A1  SMART-Seq解析とは、タカラバイオが販売するRNA-Seqライブラリー作製試薬であるSMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kitを使用したRNA-Seq解析です。
タカラバイオが提供するRNA-Seq解析のアプリケーションの種類および特長は下記となります。

<SMART-Seq解析(mRNA対象)>
SMART-Seq解析は、1~1,000細胞またはpgオーダーのtotal RNAなどの微量検体からcDNAを調製することができるSMART-Seq v4 Ultra Low Input Kit + Nextera XT DNA Library Prep Kitを使用して、non-strandedライブラリー作製を行うRNA-Seq解析メニューです。
total RNA供与量は50 ng以上をお願いしています。cDNAサンプルでの受入も可能ですが、SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit、SMART-Seq HT KitまたはSMART-Seq Single Cell Kitで合成したcDNAに限ります。

<RNA-Seq解析(mRNA対象:TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit)>
PolyA精製後、TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kitを使用してStrandedライブラリーを作製します。
total RNA供与量 4 μg(または8 μg)以上をお願いしています。

<RNA-Seq解析(total RNA対象:SMART-Seq Stranded Kit)>
total RNAからSMART-Seq Stranded Kitを用いてStrandedライブラリーを作製します。ヒト、マウス、ラットが対象です。
FFPE由来などの分解が進んだRNAの解析、polyAを持たないnon coding RNAを含む解析が可能です。
total RNA供与量 50 ng以上をお願いしています。
Q2 GeneChipなどのマイクロアレイ解析とNGSのRNA-Seq解析、どのような違いがありますか?
A2  どちらも網羅的に遺伝子発現を解析する手法ですが、マイクロアレイ解析は設計されているプローブのみの検出となります。RNA-Seq解析は新規の領域を含めて測定可能で、マイクロアレイがない生物種でも対応可能です。
またGENCODE登録のタンパク質をコードする遺伝子では約77%が複数の転写産物を持っており、それらの遺伝子で転写産物単位を区別して発現解析を行うには、RNA-Seq解析が有効です。

<解析対象に関する疑問>

Q3 遺伝子情報の無い生物種や、データベースに登録の無い新規転写産物も探索したいです。可能ですか?
A3  ロングリードシーケンサー(PacBio Sequel II)を使用したRNA-Seq解析で、de novo RNA-Seq解析Iso-Seq解析をご検討ください。
Q4 lncRNAやアンチセンスRNAの解析は可能ですか?
A4  可能です。ヒト、マウス、ラットが対象のSMART-Seq Stranded Kitを用いた方法がございます。
Q5 菌体のRNA-Seqを依頼することは可能ですか?特別な作業が発生しますか?
A5  現在、弊社では原核生物のrRNA除去処理は対応しておりません。
原核生物の場合は、rRNAを除去したRNAをご提供ください。

<データに関する疑問>

Q6 既知遺伝子の発現を調べたい場合、シーケンスデータ量は1検体あたりどの程度取得したらよいですか?
A6  mRNAを対象とした解析の場合、4,000万リード(2,000万フラグメント)/検体を取得することで低発現の遺伝子も検出できます。(ヒトなど哺乳類の場合)
total RNAを対象とした解析は、mRNAだけでなくlncRNAなども検出されますので、多めの8,000万リード(4,000万フラグメント)/検体の取得が目安になります。
Q7 発現量のFPKM値とTPM値の違いを教えてください。
A7  FPKMはfragments per kilobase of exon per million reads mappedの略であり、100万マッピングフラグメント当たりの、エクソン1 kbのリード数となります。
TPMはtranscripts per millionの略であり、遺伝子長がすべて同じとした際の100万マッピングフラグメント当たりのフラグメント数となります。
最近ではTPMがより実際の遺伝子発現との一致が高いとされており、正規化の方法としてよく利用されています。
Q8 他社で取得したシーケンスデータについて、遺伝子発現解析をタカラバイオに依頼したいです。どのような情報を提供したらいいですか?
A8  解析にはゲノム配列(FASTA形式)および遺伝子アノテーションファイル(GTF形式)が必要です。
特に指定がない場合は、GENCODEおよびEnsemblから取得したデータを使用します。
データ取得サイトを指定したい場合やデータのファイル形式が異なる場合などは別途ご相談ください。
Q9 過去に取得したマイクロアレイの結果と比較することは可能ですか?
A9  直接の比較解析はできません。同じ手法で取得したデータ同士で比較する必要があります。
Q10 論文などに使用できるヒートマップ図などを作成してもらえますか?
A10  論文用の図の作成サービスは行っておりません。

<サンプルに関する疑問>

Q11 RNA抽出の推奨キットを教えてください。
A11  検体の形状により、使用するキットが異なります。弊社ではNucleoSpin RNA抽出キットなども販売しております。
https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100006669
Q12 急ぎRNAサンプルを送りたいです。こちらでサンプルの品質は確認しなくていいですか?
A12  弊社にてRNAの品質検定を実施しますが、可能な限り事前に品質検定を実施してください。分解などの問題がある場合は再送などをご相談いたします。
また、短納期SMART-Seq解析(約2週間納品)では、提供いただいた情報をもとに作業を行いますので、事前のRNA品質検定が必須となります。
Q13 提供予定のRNAが正確な定量が困難なほど微量なのですが、受入可能ですか?
A13  はい、可能です。
価格や納期についてはお問い合わせください。
Q14 FFPEサンプル由来のRNAは解析可能ですか?
A14  はい、可能です。
ライブラリー作製試薬はSMART-Seq Stranded Kitを使用します。
ただし、RNAの分解が強く進行しているとライブラリー作製不良となるリスクが高くなります。

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