Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I)

1. 以下の反応液を調製する。

   DNA	1 μg
   10×Klenow Buffer*1	2.5 μl
   2.5 mM dNTP Mixture	2 μl （final 0.2 mM）
   Klenow Fragment*2	0.1 U
   滅菌蒸留水	25 μlにfill up

   
   *1：Klenow Fragment（製品コード 2140A/B）に添付
       (100 mM Tris-HCl(pH7.5)，70 mM MgCl₂，1 mM DTT)
   *2：1× Klenow Bufferで希釈する。
   
2. 37℃で10～30分間反応する。
3. 70℃、10分間で酵素を熱失活する。必要があれば、フェノール処理後、エタノール沈殿を行って次のステップにすすむ。

［注意］
Klenow Fragmentは、3'-exonuclease活性を持っているので、1 μgあたり1U以上用いると、むしろ修復効果が低下します。37℃反応の場合、1 μｇDNAあたり0.1U程度使用するようにしてください。
3'-exonuclease活性は低温では阻害されるので、低い温度で長時間（10℃で1時間あるいは0℃で3時間）反応させる方法も効果的です。この場合、Klenow Fragmentは1 μg DNA あたり3Uまで使用できます。