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Trans
IT-X2
®
Reagent
ZsGreen1発現293Tクローン細胞を用いたRNPでのゲノム編集
Trans
IT-X2
®
Reagent
ZsGreen1発現293Tクローン細胞を用いたRNPでのゲノム編集
【実験の流れ】
【方法】
試薬の準備
Cas9タンパク質:
Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl)(製品コード 632641)
sgRNA:
Guide-it sgRNA
In Vitro
Transcription Kit(製品コード 632635)
によりZsGreen1遺伝子に対するsgRNAを調製
遺伝子導入試薬:
Trans
IT-X2(製品コード MIR6003)
またはA社遺伝子導入製品。
1日目:細胞の準備
ZsGreen1発現293Tクローン細胞 (ZsGreen1を1 copy/cell保持)(293T-ZsGreen1細胞)を3.5×10
5
cells/mlに調製し、0.5 mlずつ24 well plateへ播種した。
2日目:RNPの細胞への導入
1.
Trans
IT-X2 (24 well pl
ate
)の場合
Opti-MEM I Reduced Serum Media 50 μlにCas9タンパク質とsgRNAを加えピペッティングした後、37℃で5分間インキュベート
Trans
IT-X2を1 μl添加してピペッティング
室温で15~30分間インキュベート
細胞へ添加
2.A社遺伝子導入製品の場合
製品protocolに準じて実施
4日目:細胞の継代
9日目:Flow cytometryによるノックアウト効率(ゲノム編集効率)の解析
ZsGreen1陰性細胞率(ノックアウト効率)をFlow cytometryを用いて解析した。
【結果】
293T-ZsGreen1細胞のZsGreen1ノックアウト効率を評価した。その結果、
Trans
IT-X2では、BおよびC条件で50%以上のノックアウト効率が認められ、A社製品を用いた場合と比較して高いノックアウト効率を示した。NTは無処理の細胞を示す。(図1)
(弊社取得データ)
図1. 293T-ZsGreen1細胞でのA社製品とのノックアウト効率の比較
Trans
IT-X2
®
Reagent