BcaBEST^® Isothermal FluorDetect Kit (DNA/RNA)

本製品は、Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法による等温核酸増幅およびRNAからの逆転写反応を行うプレミックスLAMP/RT-LAMP試薬です。
LAMP法は特定の領域を増幅するための等温核酸増幅法で、鎖置換活性を持つDNAポリメラーゼと4～6本のターゲット領域特異的プライマーを使用し、微量の核酸から目的の領域を増幅します。さらに、鋳型がRNAの場合は、DNAポリメラーゼと逆転写酵素によりワンステップRT-LAMPを行うことができます。
本製品のBcaBEST Isothermal Mix (2X)には、BcaBEST DNA Polymerase ver.2.0およびPrimeScript III Reverse Transcriptaseが含まれており、核酸サンプル（DNAまたはRNA）、プライマー、キット添付のTB Green Solution（インターカレーター）と混合してリアルタイムPCR装置などを用いて63℃ 20分の等温条件で反応させることにより、その増幅産物を蛍光で検出します。また、本試薬にはUracil-N-Glycosylase（UNG）が添加されており、増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防ぐことができます。

LAMP法の原理
LAMP法では、はじめに図1に示す鋳型と4種類のプライマーを使って、図2に示すダンベル型DNAが生成されます。
次に、これらのダンベル型DNAが鋳型となり、指数関数的増幅が生じます。ダンベル型DNAのループ部分に結合したFIP（Forward internal primer）およびBIP（Backward internal primer）の3’末端と、自己と相補的なF1およびB1領域の3’末端が増幅の起点となります。任意の2種類のプライマー（Loop Primer FおよびLoop Primer B）を併用し、計6種類のプライマーを用いた場合、指数関数増幅ステップにおける増幅起点が増えるため、さらに増幅効率が向上します。
LAMP法の詳しい増幅原理図はこちら

RR385A（100回、25 μl反応系）

BcaBEST Isothermal Mix (2X)	625 μl	×2
TB Green Solution（300×）	50 μl

RR385S（20回、25 μl反応系）

BcaBEST Isothermal Mix (2X)	250 μl
TB Green Solution（300×）	50 μl

－20℃

Real-Time LAMP/Real-Time RT-LAMP

BcaBEST Isothermal Mix (2X)にはPyrophosphatase (inorganic)が含まれ、増幅反応で生じるピロリン酸は分解されるため、濁度による検出はできません。

本製品を使用する際の注意事項です。使用前に必ずお読みください。

1. BcaBEST Isothermal Mix (2X)は、氷上にて融解後、軽く混合したのちスピンダウンして使用してください。使用後は、直ちに－20℃に保存してください。
2. TB Green Solutionは核酸と結合する性質上、変異原性の可能性のあるものとして取り扱ってください。使用時は必ず手袋を着用してください。
3. 試薬の分注を行うときは必ず新しいディスポーザブルチップを用い、サンプル間のコンタミネーションを防止してください。
4. 必要分＋αの反応液（BcaBEST Isothermal Mix (2X)、Primer Mix、TB Green Solution、RNase free waterの混合液）を調製すると便利です。組成の均等な反応液を最少回数分注することで、試薬調製のばらつきを最小限に留めることができます。その結果、実験間のデータのばらつきも防げます。
5. 増幅反応後のチューブの開閉やオートクレーブ処理は実験室内で高濃度の核酸汚染が発生する原因となりますのでお控えください。