WEB会員ログインが必要です
1. | PrimeScript RTase (200 U/μl) | 5 μl |
2. | RNase Inhibitor(40 U/μl) | 5 μl |
3. | Oligo (dT) 18 Anchor Primer(1 μg/μl)*1 | 10 μl |
4. | 5×1st Strand Synthesis Buffer*2 | 20 μl |
5. | 1st Strand dNTP Mixture | 6 μl |
6. | E. coli RNase H/E. coli DNA Ligase Mixture | 10 μl |
7. | E. coli DNA Polymerase I(20 U/μl) | 10 μl |
8. | 2nd Strand dNTP Mixture*2 | 23 μl |
9. | 5×2nd Strand Synthesis Buffer*2 | 150 μl |
10. | T4 DNA Polymerase(1 U/μl) | 20 μl |
11. | 10×T4 DNA Ligase Buffer | 20 μl |
12. | T4 DNA Ligase(350 U/μl) | 20 μl |
13. | EcoR I-Sma I Adaptor(0.4 μg/μl) | 18 μl |
14. | Not I Supplement | 135 μl |
15. | Not I(50 U/μl) | 15 μl |
16. | tRNA (10 μg/μl) | 5 μl |
17. | Dr. GenTLE Precipitation Carrier*3 | 60 μl |
18. | 3 M Sodium Acetate(pH5.2) | 1 ml |
19. | pAP3neo Predigested Vector(100 ng/μl)*4 | 5 μl |
20. | RNase-free H2O | 640 μl |
21. | Control RNA(1 μg/μl)*5 | 5 μl |
22. | T7 promotor primer*6(5 pmol/μl) | 20 μl |
23. | T3 promotor primer (for pAP3neo)*6(5 pmol/μl) | 20 μl |
Spin Column | 5本 |
*1 Oligo (dT)18 Anchor Primerには、Not Iサイトの他にXho Iサイトも付加されています(配列情報参照) 。Not IではなくXho I消化を行うことで、EcoR I - Xho Iフラグメントとして二本鎖cDNAを調製することも可能ですので、これらのサイトを利用したベクター (脱リン酸化されたものは不可)でのcDNAライブラリー構築にも使用できます。なお、本キットにはXho I消化用の酵素などは含まれていませんので、別途用意してください。
*2 PrimeScript Double Strand cDNA Synthesis Kit(製品コード 6111A)に含まれるものとは組成が異なります。
*3 Genとるくんエタ沈キャリア(製品コード 9094)と同じものです。
*4 EcoR I, Not Iで切断済みです。
*5 本キットに添付されているControl RNAは、SP6 promoter領域の下流にpBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を含む約1.4 kbの断片を挿入したプラスミドpSPTet3を鋳型にして、SP6 RNA Polymeraseを用いてin vitro transcriptionにより合成したものです。本キットには1反応分(5 μg)のControl RNAが含まれます。
なお、Control RNAは、30個のアデニン塩基よりなるpolyA tailを持つ鎖長約1.4 kbのpolyA tailで、このRNAを鋳型に二本鎖cDNAを合成して、適当なプラスミドに挿入した際、二本鎖cDNAがfull-lengthのものであれば、プラスミドはテトラサイクリン耐性になります。
*6 インサートチェック及びシーケンスに使用可能です。配列情報は、こちら。T7 promoter primerは、BcaBEST Sequencing Primer T7(製品コード 3884)と同じ配列です。
注) 本製品には形質転換に必要な大腸菌は含まれません。メチル化DNAによる形質転換(エレクトロポレーション法)が可能な大腸菌、E. coli HST08 Electro-Cells(製品コード 9028)、 ClontechのSupercharge EZ10 Electrocompetent Cells(製品コード 636756)などを別途ご用意ください。
total RNAからpolyA+ RNAを精製(スピンカラムタイプ)
二本鎖cDNA合成
エタノール沈殿用の核酸共沈剤
SMART法による完全長cDNAの取得(改良版)
動物組織、細胞、バクテリア、酵母などからのtotal RNA調製