短時間の簡便な操作で高純度ヒスタグ融合タンパク質の精製が可能
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- 次世代メンブレン技術を用いたHisタグ精製キット
- Miniprep、Maxiprep、24 well、96 well、Large Volumeの5種類をご用意
- 室温、短時間の操作でHisタグ融合タンパク質を簡単精製
- ベッドボリュームが小さく、高純度、高収量、高濃度の溶出が可能
- 非変性、変性条件下でEDTAや還元剤、グリセロールなどを含むサンプルから精製可能
- 哺乳類細胞やバクテリアサンプルに対応
- 添付xTractor Bufferに加えて、他のLysis Bufferにも適合
製品説明
Capturem His-Tagged Purificationシリーズは次世代メンブレン技術を用いてヒスチジンタグ（Hisタグ）融合タンパク質を精製できる革新的なキットで、従来の金属レジンの使用範囲を超えた幅広い条件に適用できる。サンプルとしてバクテリアと哺乳類細胞ライセートの両方が使用でき、変性条件下（8 M尿素、6 Mグアニジン塩酸塩）での使用も可能である。また、EDTA、還元剤（βメルカプトエタノール、DTT、TCEPなど）、グリセロールなどの添加剤を含む幅広い条件下でも優れた性能を発揮する。タンパク質のタンデムアフィニティー精製にも使用可能である。
本シリーズは、高性能ナイロンメンブレンを用いており、細胞溶解液の添加から溶出までの室温操作が可能で処理時間が短いためタンパク質の劣化や失活の懸念が少なく、待ち時間のない手軽な操作で質の高い精製が可能である。
化学的修飾により孔の表面積を拡大したナイロンメンブレンは、ベッドボリュームが少なく（2 μl：Miniprepの場合）、Hisタグ融合タンパク質の結合能が高く（≧75 mg/cm3）、高純度、高濃度での精製が可能である。ラインナップはMiniprep、Maxiprep、24 well、96 well、Large Volumeの4種類があり、各製品の詳細は下記に記した。
図1．Capturem His-Tagged Purificationのワークフロー
本シリーズは、高性能ナイロンメンブレンを用いており、細胞溶解液の添加から溶出までの室温操作が可能で処理時間が短いためタンパク質の劣化や失活の懸念が少なく、待ち時間のない手軽な操作で質の高い精製が可能である。
化学的修飾により孔の表面積を拡大したナイロンメンブレンは、ベッドボリュームが少なく（2 μl：Miniprepの場合）、Hisタグ融合タンパク質の結合能が高く（≧75 mg/cm3）、高純度、高濃度での精製が可能である。ラインナップはMiniprep、Maxiprep、24 well、96 well、Large Volumeの4種類があり、各製品の詳細は下記に記した。
| Miniprep Kit | Maxiprep Kit | 24 well plate | 96 well plate | Large Volume | |
|---|---|---|---|---|---|
 Miniprep Column |
 Maxiprep Column |
 24 Well Plate |
 96 Well Plate |
 Large Volume Unit |
|
| サンプル容量 | ～800 μl | ～25 ml | ～4 ml | ～1,000 μl | 150～500 ml |
| 回 数 | 20回 | 6回 | 24 well | 96 well | 4回 |
| 所要時間 | 5分 | 15分 | 15分 | 15分 | 15～30分 |
| 最大収量＊ | 80 μg | 1.5 mg | 800 μg | 80 μg | 10～25 mg |
| 遠心条件 | 11,000×g 1分 | 2,000×g 3分 | 600×g 2分 | 2,000×g 3分 | × |
| 吸引濾過 | × | × | ○ | ○ | ○ |
| Buffer添付 | あり | あり | なし | なし | なし |
※ サンプルのタイプ、種類、抗体アイソタイプによって異なります。
まず、xTractor Bufferをメンブレンの入ったカラムに添加し、カラムの平衡化を行う。そして、タグ融合タンパク質をスピンカラムのメンブレンに添加し、結合させる。続いて、洗浄バッファーを加えて洗浄した後、溶出バッファーで溶出すれば精製操作は完了する。
Miniprepと96 well plateは100 μlの溶出バッファーで、Maxiprep Kitでは500 μlの溶出バッファーで90％以上の溶出が可能である。
表1．Capturem His-Tagged PurificationのBufferの組成
図2．Capturem His-Tagged Purificationの革新的膜テクノロジー
表2．Capturem His-Tagged Purificationtに使用できる添加剤の濃度
図3．Capturem His-Tagged Purification Miniprep Kitにおける添加剤の影響
図4．Capturem His-Tagged Purification Miniprep Kit変性剤の影響
図5．哺乳類細胞で発現させたHisタグ融合タンパク質の精製
| Buffer | 組成 |
|---|---|
| Lysis Buffer | xTractor Buffer（製品コード 635625）を推奨。他のスタンダートなlysis bufferも使用可能。 |
| Wash Buffer | 150 mM NaCl, 20 mM Na3PO4, pH7.6 |
| Elution Buffer | 500 mM NaCl, 20 mM Na3PO4, 500 mM imidazole, pH7.6 |
Membrane表細の独自ポリマー構造により、大きな膜表面積と高容量を実現している。そのため精製に長時間を要するレジンカラムに比べ、サンプル溶液が新テクノロジーの高容量膜細孔の中を迅速に通過し、短時間での精製が可能である。また低い圧力でサンプル溶液が通過するため、タンパク質の品質低下を招かない。またBed volumeが小さく、洗浄バッファーの残存がない高純度精製が可能である。
| 添加剤 | 濃度 |
|---|---|
| MOPS | 200 mM |
| HEPES | 200 mM |
| Tris | 200 mM |
| EDTA | 10 mM |
| β-mercaptoethanol | 30 mM |
| DTT | 10 mM |
| TCEP | 5 mM |
| Guanidine-HCl | 6 M |
| Urea | 8 M |
| Nonionic detergent (Triton X-100) | 2％ |
| Nonionic detergent (Tween 20) | 2％ |
| Anionic detergent (SDS) | 1％ |
| Arginine | 500 mM |
| Glycine | 100 mM |
| Histidine | 20 mM |
| Sodium chloride | 2 M |
| Imidazole | 40 mM |
| Glycerol | 10％ |
Capturem His-Tagged Purification Miniprep Kitを用いて、各種添加剤存在下で6×Hisタグ融合GFPuvタンパク質を精製した。それぞれ、サンプル、平衡化バッファー、洗浄バッファー、溶出バッファーに添加剤を加えて精製し、300 μlの溶出バッファーで2回溶出した。
Capturem His-Tagged Purification Miniprep Kitを用いて、8 M尿素または6 Mグアニジン塩酸塩存在下でHisタグ融合GFPuvタンパク質を精製した。スピンカラムに800 μlの菌体ライセートを加え、非変性、または変性条件下で精製した。変性条件下では、サンプル、および各バッファーに8 M尿素、または6 Mグアニジン塩酸塩を添加した。
293T細胞に、6×Hisタグを付加したMAPK1、またはADRB2をコードするプラスミドをトラスフェクションし、Capturem His-Tagged Purification Miniprep Kitを用いて発現タンパク質を精製した。平衡化したカラムに細胞ライセートを通し、洗浄バッファー400 μlで洗浄後、溶出バッファー300 μlで溶出した。各フラクションを4～20％ポリアクリルアミドゲルで泳動後、ニトロセルロースメンブレンにブロッティングし、ポンソーS染色、およびウェスタンブロッティングを行った。ポンソー染色（左）では、MAPK1(上)、ADRB2（下）とも、各フラクションの全てのバンドが染色される。
ウェスタンブロッティング(右)には、MAPK1(上)、ADRB2(下)に特異的な抗体を用いた。
（左）Capturem His-Tagged Purification Large Volume Units
（右）Bottle Thread Adaptor
（A）
（B）
（C）
（D）
（A）33 mm径のボトルに設置したCapturem His-Tagged Purification Large Volume Unit
（B）6xHis-GFPuvタンパク質を含む細胞溶解液をユニットにアプライした。
（C、上）アプライ、洗浄後の膜表面。GFP由来の黄緑色をしている。
（C、下）溶出後の膜表面。元の膜色の白色である。
（D）50 mlチューブ中に溶出された6xHis-GFPuvタンパク質。
実験操作動画
内容
・Capturem His-Tagged Purification Miniprep Kit（製品コード 635710）
・Capturem His-Tagged Purification Maxiprep Kit（製品コード 635713）
・Capturem His-Tagged Purification Large Volume（製品コード 635724）
Capturem His-Tagged Purification Large Volume Unit 4個(2 Units per box)
Bottle Thread Adaptor 1個
| Capturem His-Tagged Purification Miniprep Column | 20本 |
| xTractor Buffer | 15 ml×2 |
| Wash Buffer | 10 ml |
| Elution Buffer | 10 ml |
・Capturem His-Tagged Purification Maxiprep Kit（製品コード 635713）
| Capturem His-Tagged Purification Maxiprep Column | 6本 |
| Capturem Maxiprep Filters | 6本 |
| xTractor Buffer | 200 ml |
| Wash Buffer | 40 ml |
| Elution Buffer | 15 ml |
・Capturem His-Tagged Purification Large Volume（製品コード 635724）
Capturem His-Tagged Purification Large Volume Unit 4個(2 Units per box)
Bottle Thread Adaptor 1個
保存
スピンカラム、Large Volume Unitおよびプレート：室温または4℃
その他：開封までは室温、開封後は4℃
その他：開封までは室温、開封後は4℃
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