small RNA Cloning Kit

細胞内で発現しているRNAの中に、タンパク質をコードしていないものが多く存在し、それらが重要な機能を持つことが明らかになってきた。これらは機能性RNAという名称で分類されているが、その中でも特に18～26塩基程度の低分子RNA（smallRNA、miRNAなど）の機能が注目されている。これら低分子RNAの機能としては、
　(1) 遺伝子発現をmRNAレベルで抑制する
　(2) 遺伝子発現を翻訳レベルで抑制する
ことがこれまでに示されている^1）、2）。
低分子RNAの発現解析を行う手段の一つとして、クローニングによる解析がある。低分子RNAはmRNAのようなpolyA tailを持たないため、分離した低分子RNA画分に対し、その5'側および3'側にRNAまたはRNA/DNAキメラのアダプターを結合させて逆転写し、PCRで増幅した後クローニングを行う方法が用いられている^3）。
本キットは、上記原理をもとにした低分子RNAのクローニング用cDNA増幅キットである。このキットでは、マグネットビーズの利用により、アダプター結合後のゲル抜きなどの煩雑な操作をできる限り除き、簡便な操作で低分子RNA由来cDNAを増幅できるよう工夫している。増幅したcDNAはそのままTAクローニングに用いることが可能である。また、アダプター配列中にある制限酵素サイトを利用したクローニングも可能になっている。

total RNAを電気泳動してゲル抜きを行うなどの操作で調製した低分子RNA（small RNA）を、本キットを用いてクローニングする場合の流れを図1に示す。

1. 調製したsmall RNAをBAP処理することにより、5'側のリン酸基をはずす。
2. BAP処理したRNAの3'側に、ビオチン化RNA/DNAキメラアダプターを結合させる。
3. ストレプトアビジン結合磁気ビーズを用いてビオチン化アダプター結合small RNAを回収し、T4 polynucleotide kinaseにより5'側にリン酸基を付与する。
4. 5'側に、RNA/DNAキメラアダプターを結合させた後、RT-primerを用いて逆転写酵素M-MLV^4）により逆転写反応を行う。
5. cDNAをビーズから回収し、PCRを行う。
6. PCR フラグメントまたは制限酵素処理したフラグメントを回収し、クローニングを行う。

Package 1

1.	RNase Inhibitor	40 U/μl	50 μl
2.	10×BAP Buffer		200 μl
3.	Alkaline Phosphatase (BAP)		20 μl
4.	0.1% BSA	0.1%	60 μl
5.	3' adaptor *1, *2		10 μl
6.	T4 RNA Ligation Buffer		600 μl
7.	T4 RNA Ligase	40 U/μl	20 μl
8.	5×T4 PNK Buffer		100 μl
9.	T4 Polynucleotide Kinase	10 U/μl	10 μl
10.	5' adaptor *1		10 μl
11.	5×RT Buffer		40 μl
12.	dNTP Mixture	各2.5 mM	90 μl
13.	PCR-R & RT-Primer *1, *3	50 pmol/μl	20 μl
14.	RTase (RNaseH free)	200 U/μl	10 μl
15.	2×PCR Buffer		250 μl
16.	PCR Primer F *1	50 pmol/μl	10 μl
17.	TaKaRa Ex Taq HS	5 U/μl	10 μl
18.	Control RNA *4	5 pmol/μl	10 μl

Package 2

19.	3 M Sodium Acetate (pH5.2)	200 μl
20.	Dr. GenTLE Precipitation Carrier *5	80 μl
21.	2×B/W Buffer	2.7 ml
22.	Magnosphere MS300/Streptavidin	100 μl
23.	RNase-free dH2O	10 ml

*1	3' adaptor、5' adaptor、PCR Primer FおよびPCR-R & RT-Primerには、Sse8387 Iのサイトが付加されている。PCR産物をSse8387 Iで消化することにより、Pst Iで切断したベクターに組み込むことができる。なお、本キットには制限酵素やクローニング用ベクターなどは含まれていないので、別途用意が必要である。
*2	3' adaptorはビオチン化されている。
*3	PCR用のreverse primer。逆転写プライマーとしても使用する。
*4	本キットに添付されているControl RNAは5’末端がリン酸化された21merの合成RNAである。
*5	Genとるくんエタ沈キャリア（製品コード 9094）と同じものである。

Package 1：－20℃
Package 2：　　4℃

<試薬>

• フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1, v/v/v）


• クロロホルム/イソアミルアルコール（24:1, v/v）


• エタノール


• TEバッファー（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH8.0）


• 0.1 N NaOH


• DNAサイズマーカー
  20 bp DNA Ladder（製品コード 3409）など


• RNAサイズマーカー
  14-30 ssRNA Ladder Marker（製品コード 3416）など


• 10%ポリアクリルアミドゲル(未変性)


• 15%ポリアクリルアミドゲル(変性)


• 制限酵素Sse8387 I(製品コード 1183)


• クローニング用ベクター


• コンピテントセル


• ライゲーション用試薬
  DNA Ligation Kit<Mighty Mix>（製品コード 6023）など

<器具>

• 微量遠心機（マイクロ遠心機）


• 恒温水槽（次の各温度設定で使用；ヒートブロックも可）
  15℃、25℃、37℃、42℃、70℃


• マイクロピペット


• マイクロ遠心チューブ


• サーマルサイクラー


• PCR用0.2 mlチューブ


• フィルター付きピペットチップ


• アガロースゲル電気泳動装置一式


• ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置一式


• マグネットスタンド
  Magnetight Separation Stand（製品コード 69964-3）など