Matchmaker™ Gold酵母ワンハイブリッド（Y1H）システム

Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening Systemは、新規のDNA結合タンパク質を特定し、その特徴を検討することができる極めて優れたシステムである（図1）。新たに抗真菌抗生物質Aureobasidin A（AbA）（1）に対する耐性遺伝子（AUR1-C）をレポーターとして採用し、より簡単で厳密なスクリーニングが可能になった。

Yeast One-Hybridシステムの概要

Matchmaker Gold Yeast One-Hybridシステムでは、DNA結合タンパク質の候補となる未知の“prey（獲物）”タンパク質をGAL4 ADに融合して発現させる。preyタンパク質が、宿主ゲノムに組み込まれた既知の“bait（おとり）”配列（標的DNA配列）に結合すると、preyタンパク質に融合したGAL4 ADによりAbA耐性レポーター遺伝子（AUR1-C）が活性化され、宿主酵母株がAbA選択培地で生育可能になる（図1）。


図1. Matchmaker Gold One-Hybridシステムによるタンパク質-DNA間相互作用の検出
bait配列を1～3コピー並べてpAbAiレポーターベクターにクローニングし、これを酵母Y1HGold株のゲノムに組込みレポーター酵母株を作製する。ライブラリーに由来するpreyタンパク質がbait配列に結合すると、AbA耐性遺伝子の活性化が起こりAbA選択培地に陽性クローンとして出現する。

また、本システムではSMART法を用いて、末端にpGADT7-Recベクター（preyベクター）の末端と相同な配列を持つcDNAプールを作製し、pGADT7-RecベクターとcDNAプールをbait配列を組み込んだ酵母Y1HGold株にコトランスフォームする。酵母内での相同組換え反応を利用することで、酵母ライブラリーの構築とワンハイブリッドスクリーニングをワンステップで行うことができる（図2）。


図2. SMART法と酵母内での相同組換え反応を利用したライブラリー構築とスクリーニング
SMART法を用いたcDNA合成により、末端にpGADT7-Recベクター（preyプラスミド）の末端と相同な配列を持つcDNAプールを作製する。次に、cDNAプールとpGADT7-Recベクターを酵母Y1HGold株に共導入し（ライブラリー構築は酵母内での相同組換え反応を利用して行われる）、これをSD/－Leu/＋AbA選択培地で培養することで候補コロニーを選択する。

本システムを用いたタンパク質-DNA間相互作用解析の流れ

Step 1.	pAbAiベクターに標的DNA配列を1～3のタンデムリピートでクローニングし、baitコンストラクトを構築する。
Step 2.	Step 1.で構築したコンストラクトを線状化し、酵母Y1HGold株のゲノムにURA3遺伝子座を利用して組込み、SD/－Ura選択培地で選択を行う。
Step 3.	Matchmaker Insert Check PCR Mix 1を用いたコロニーPCRにより、bait配列のゲノムへの組込みを確認する（図3、パネルA）。
Step 4.	SMART法により、線状化したpGADT7-Recベクターの末端と相同な末端配列をもつcDNAを合成する。
Step 5.	Step 4.で合成したcDNAを、線状化pGADT7-Recベクターとともに、Step 2.で構築した酵母Y1HGold[Bait]株にコトランスフォームし、AbA選択培地でスクリーニングする（図2）。
Step 6.	Step 5.で取得した陽性と考えられるコロニーについて、これがもつライブラリーのインサートcDNAを、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2を用いて解析する（図3、パネルB）。

Matchmaker Insert Check PCR Mix 1は、PCR酵素、プライマー、dNTPs、バッファーがあらかじめ混合された、酵母コロニーから直接PCR増幅が行える2×のプレミックスPCR反応液である。本製品を用いれば、Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Systemにおいて、酵母Y1HGold株へのbait配列の組込みを、コロニーPCRにより迅速、簡便に確認することができる（図3、パネルA）。
また、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2を用いれば、One-Hybrid（およびTwo-Hybrid）スクリーニングで出現した候補コロニーから、次の実験ステップに進める陽性クローンをコロニーPCRにより迅速に選択することができる（図3、パネルB）。


図3. コロニーPCRによる陽性クローンの選択例
パネルA：Matchmaker Insert Check PCR Mix 1を用いて、酵母Y1HGold株ゲノムDNAへのbait配列（3コピーのOct4、またはp53結合配列）の挿入の有無をコロニーPCRにより確認した。bait配列の挿入のある株からは約1.4 kbの増幅産物が確認できるが、挿入のない株からは増幅が認められない。
レーン1：Y1HGold　レーン2：Y1HGold [AbAi]　レーン3：Y1HGold [3xOct4-AbAi]　レーン4：Y1HGold [3xp53-AbAi]　レーンM：1 kb ladder
パネルB：Matchmaker Goldシステムを用いたスクリーニングより得られた陽性候補クローンからランダムに15コロニーを選び、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2を用いてPCR増幅を行った（レーン2～16）。preyプラスミドのインサートcDNAを簡便に解析することができ、次の実験ステップに進めるコロニーを迅速に選択することができる。
レーン1：No template control　レーンM, M2：1 kb ladder　レーンM1：100 bp ladder

One-Hybridのための酵母生育培地

本システムのための酵母生育培地パウチセットをご用意している。必要な液体培地、または寒天培地を作製するためのプレミックス酵母用培地がセットになっており、水（ddH₂O）に溶解してオートクレーブするだけで培地調製が完了する。

Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System
（製品コード 630491）
Box1：
・SMART MMLV RTase
・5× First-Strand Buffer
・DTT
・CDS III Primer
・CDS III/6 Primer
・5’PCR Primerおよび3’PCR Primer
・RNase H
・Melting Solution
・dNTP Mix（10 mM each）
・pGADT7-Rec AD Cloning Vector（linearized）
・pAbAi Vector
・p53-AbAi Control Vector
・p53 Control Insert
・pGADT7 AD Vector
Box2：
・Yeastmaker Yeast Transformation System 2
（Yeastmaker Carrier DNA, pGBT9）
Box3：
・Yeastmaker Yeast Transformation System 2
（50% PEG, 1M LiAc, 10× TE Buffer, YPD Plus Liquid Medium）
Box4：
・SMART III Oligonucleotide
・Control PolyA⁺ RNA
・S. cerevisiae Y1HGold
Box5：
・YPDA Broth
・YPDA with Agar
・SD/-Ura with Agar
・NaCl Solution
・Deionized H₂O
・CHROMA SPIN+TE-400 Columns

#630491
　Box 1、2：－20℃
　Box 4：－70℃
　Box 3、5：室温
#630496、630497：－20℃