分泌型ルシフェラーゼレポーターアッセイ

Ready-To-Glow Secreted Luciferase Systemは、Metridia longa由来の分泌型ルシフェラーゼを用いた新しいレポーターシステムである。レポータータンパク質がトランスフェクトした細胞の培養上清中に分泌されるため、活性を測定するために細胞を溶解する必要がない。培養上清中のレポーター活性は、分泌型Metridiaルシフェラーゼに特異的な基質を添加することで検出できる。細胞溶解の必要がないため、同じ培養ウェルから繰り返しサンプリングして遺伝子発現の経時的な解析を行うことができるほか、同じ培養ウェルの細胞を用いたノーザンブロットやRNaseプロテクションアッセイ、ウェスタンブロットなど他の解析を行うことも可能である。

操作性に優れた分泌型レポーターアッセイ
これまでレポーターとしてよく利用されてきたホタルルシフェラーゼやRenillaルシフェラーゼは、細胞質局在性のタンパク質であるため、基質を添加する前にまず細胞溶解を行う必要があった。そのため、培地の除去や細胞の洗浄などの作業が必要となり、データにばらつきが生じる原因にもなっていた。Ready-To-Glow Secreted Luciferase Systemは、培養上清をサンプリングしてアッセイを行えるため、これらの影響を考えることなく、迅速かつ簡便に定量データを取得することができる（図1）。



図1. 分泌型ルシフェラーゼと非分泌型ルシフェラーゼの実験フローの比較

高いシグナル強度と広いダイナミックレンジ
分泌型Metridiaルシフェラーゼは、Renillaルシフェラーゼやホタルルシフェラーゼなどの非分泌型ルシフェラーゼレポーターと比較して、基質添加後に高いシグナル強度とシグナル安定性を示す（図2）。また、Metridiaルシフェラーゼは非常に広い濃度範囲で直線性を示し、少なくとも6桁のダイナミックレンジを示す（図3）。検出限界は非常に低く、96ウェルプレートの場合は2 fg/well（40 fg Metridiaルシフェラーゼ/1 mlサンプル）である（図4）。

ハイスループット解析に適したホモジニアスアッセイ系
Ready-To-Glowシステムは、細胞溶解ステップが不要で、培養上清をサンプリングし、基質／反応バッファーを添加するだけで簡便にアッセイが行えるホモジニアスアッセイ系であるため、HTS解析に非常に適している（図5）。従来の非分泌型ルシフェラーゼを用いたアッセイでは、培地の除去、細胞の洗浄、細胞の溶解など煩雑な作業が必要であり、データにばらつきが生じる原因にもなっていたが、分泌型ルシフェラーゼはこれらの影響を考えることなく定量データを取得できる。
特にReady-To-Glow Automation KitはHTS解析のためのキットであり、通常の10倍量のReaction Bufferと、HTS解析に適したプロトコールが供給されているため、自動分注装置などを用いた場合でも再現性の高い結果が得られる。

Ready-To-Glow MetLuc Monoclonal Antibody
本製品は、組換えタンパク質のMetridia由来ルシフェラーゼと同様に、動物細胞で発現したMetridia由来ルシフェラーゼも検出できるモノクローナル抗体である。ウェスタンブロット解析で20 ngまでのタンパク質も検出可能である。


図2. 分泌型Metridiaルシフェラーゼの強いシグナル強度と安定性
CHO細胞を96ウェルプレートで培養し、CMVプロモーター制御下の分泌型Metridiaルシフェラーゼ、非分泌型Renillaルシフェラーゼ、および非分泌型ホタルルシフェラーゼを一過的にトランスフェクトした。24時間後、等量サンプル中のルシフェラーゼ活性をそれぞれ推奨される基質で測定し、シグナル強度と基質添加後のシグナルの安定性を比較した。シグナルは45分間経時的に測定した。neg＝陰性コントロール



図3. Metridiaルシフェラーゼの直線性
CHO細胞およびHEK293細胞にpMetLuc-Controlベクターを一過的にトランスフェクトした。その後、サンプリングした培養上清をグラフ中の濃度になるように10% FBSを含むDMEMに段階希釈し、分泌型Metridiaルシフェラーゼの活性を測定した。Metridiaルシフェラーゼの活性は96ウェル（パネルA）、または384ウェルフォーマット（パネルB）でプロトコールに従い測定した。



図4. 分泌型Metridiaルシフェラーゼの検出限界
Metridiaルシフェラーゼをグラフ中に示した濃度で10％ FBSを含むDMEMに添加し、Metridiaルシフェラーゼ活性をSpectraMax Lの96ウェルフォーマットで測定した。検出限界は2 fg/well （40 fg/ml）であった。



図5. 分泌型MetridiaルシフェラーゼのHTS解析への応用例
フォルスコリン応答性Metridiaルシフェラーゼ遺伝子（pASM-Lu164）を安定的に導入したCHO細胞を含む1,536ウェルプレートをCCDカメラで撮影した。1,536マイクロタイタープレートの各ウェルには300個のCHO細胞を添加した。フォルスコリンの濃度を図に示すように増加させ、37℃で4時間細胞を培養した。Metridia基質の濃度も図に示すように増加させて添加し、CCDカメラを用いて可視化した（Integration time： 60 sec） （Bayer Health Care, Germanyの提供）。擬似カラーは発光強度を反映しており、黄色で示された領域が最も明るく、黒で示された領域が最も暗い。

Ready-To-Glow Secreted Luciferase Reporter Assay
（製品コード 631726、631727、631728）
・Substrate Buffer
・Reaction Buffer
・Lyophilized Secreted Luciferase Substrate

Ready-To-Glow Automation Kit
（製品コード 631740）
・Substrate Buffer
・Reaction Buffer
・Lyophilized Secreted Luciferase Substrate

－20℃