FFPE DNA、cfDNA解析用のライブラリー調製キット
- サンプルを濃縮せずに使用できるシンプルな1チューブワークフロー
- インプット量によらず再現性が高く、均一なカバレッジ
- 5～200 ng（インプット量 30 μl）のFFPE由来DNAおよびcfDNAが使用可能
- GC含量の高い領域もバイアスの少ないパフォーマンス
- DNA断片化酵素を含む”完璧”なPLUS Kitもラインナップ
製品説明
ThruPLEX DNA-Seq HVケミストリーは、最大30 μlのインプット量から、高い多様性と均一なGCカバレッジを備えたDNAライブラリーを作製するために最適化されている。
ライブラリー調製には、5～200 ngの断片化された二本鎖DNAを用いることが可能である。3ステップのワークフローは約2時間で、同一チューブまたは同一ウェルで行われ、操作途中の精製ステップやサンプルの移し替えは不要のため、取り扱いミスや貴重なサンプルの損失を防ぐことができる。ThruPLEX DNA-Seq HVライブラリーは、ターゲット濃縮キットと組み合わせることができ、高品質のシーケンス結果を提供できる。ThruPLEX DNA-Seq HVとThruPLEX HV UDI (ユニークデュアルインデックス）を使用することにより、最大96個のライブラリーを混合できるように設計されている。精製および定量化されたライブラリーは多様性が高く、イルミナ社NGS装置に対応している。本キットは、全ゲノムシーケンス、全エクソームシーケンスまたはターゲット濃縮キットと組み合わせることにより、カバレッジの高いシーケンス結果を提供できる。血漿由来のセルフリーDNAやFFPEサンプルからの損傷DNAなど、断片化されたDNAの使用に最適である。
ライブラリー調製には、5～200 ngの断片化された二本鎖DNAを用いることが可能である。3ステップのワークフローは約2時間で、同一チューブまたは同一ウェルで行われ、操作途中の精製ステップやサンプルの移し替えは不要のため、取り扱いミスや貴重なサンプルの損失を防ぐことができる。ThruPLEX DNA-Seq HVライブラリーは、ターゲット濃縮キットと組み合わせることができ、高品質のシーケンス結果を提供できる。ThruPLEX DNA-Seq HVとThruPLEX HV UDI (ユニークデュアルインデックス）を使用することにより、最大96個のライブラリーを混合できるように設計されている。精製および定量化されたライブラリーは多様性が高く、イルミナ社NGS装置に対応している。本キットは、全ゲノムシーケンス、全エクソームシーケンスまたはターゲット濃縮キットと組み合わせることにより、カバレッジの高いシーケンス結果を提供できる。血漿由来のセルフリーDNAやFFPEサンプルからの損傷DNAなど、断片化されたDNAの使用に最適である。
ThruPLEX DNA-Seq HV PLUS Kitは、ThruPLEX DNA-Seq HVにThruPLEX HV PLUS Enzymatic Fragmentation Moduleが含まれた製品である。
ThruPLEX DNA-Seq HVのエンドリペアのステップと並行して、ThruPLEX HV PLUS Enzymatic Fragmentation Moduleに含まれる酵素により、サンプルDNAのサイズ調製可能な断片化を行うことが可能である。 この製品により、機械的断片化や別の酵素による断片化を行っていた時間を省略することができる。
ThruPLEX DNA-Seq HVのエンドリペアのステップと並行して、ThruPLEX HV PLUS Enzymatic Fragmentation Moduleに含まれる酵素により、サンプルDNAのサイズ調製可能な断片化を行うことが可能である。 この製品により、機械的断片化や別の酵素による断片化を行っていた時間を省略することができる。
注意）ThruPLEX HV UDI Kitは、ThruPLEX DNA-Seq、ThruPLEX Tag-Seq、ThruPLEX Plasma-Seq Kitなど、従来のバージョンのThruPLEX Kitとは互換性がありません。 ThruPLEX「HV」キットとのみ互換性があります。
すべてのインデックスは、ベースコール用の2または4チャンネルケミストリーを使用するイルミナ社シーケンサーシステム（例：MiSeq、NovaSeq、MiniSeq、NextSeq、およびHiSeqプラットフォーム）で機能することが検証されています。1チャンネルケミストリーを使用するシステム（例：iSeq）では検証されていません。
すべてのインデックスは、ベースコール用の2または4チャンネルケミストリーを使用するイルミナ社シーケンサーシステム（例：MiSeq、NovaSeq、MiniSeq、NextSeq、およびHiSeqプラットフォーム）で機能することが検証されています。1チャンネルケミストリーを使用するシステム（例：iSeq）では検証されていません。
ThruPLEX DNA-Seq HVワークフローは、同一チューブ(またはウェル)で行われる3つの簡単なステップで構成されており、操作途中での精製ステップやサンプルの移し替えの必要がない。本キットは、高いインプット容量（30 μl）、最大200 ngまでのサンプルの使用が可能なため、サンプルの濃縮が不要で、多様性の高いライブラリーの作製が可能である。
H. influenzae（インフルエンザ）51907D-5、E. coli（大腸菌）11303、またR.palustris（ロドプソドモナス）BAA-98D-5（ATCC）の各100、50、および5 ngを使用して、ThruPLEX DNA-Seq HVを用いてライブラリーを3連で作製した。AMPureビーズで精製後、NextSeq 150 Cycle Mid Output（2×75 bp）でペアエンドシーケンスを行った。正規化されたカバレッジは色付きの線で表され、各GC％で予想される100 bp領域の数は縦の線で表される。H. influenzaeゲノムのサイズは1.85 Mb、GC含有量は38％。大腸菌ゲノムのサイズは4.7 Mb、GC含有量は51％。R. palustrisゲノムのサイズは5.45 Mb、GC含有量は65％。
GC含量の異なるサンプルにおいても均一なGCカバレッジを示した。
HCT116、RKO、およびSW48細胞からプールされたgDNA（Horizon Discovery）の5 ngおよび50 ngを使用してライブラリーを3連で作製した。ライブラリーは、ThruPLEX DNA-Seq HV（ThruPLEX HV）またはA社キットのプロトコールに従った。ペアエンドシーケンスは、NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2.5（150サイクル）で行い、リード数はtotal 800万リードにダウンサンプリングした。縦の灰色のバーは、100 bp windowsを用いて予想されるGC含量分布を表している。 ThruPLEX DNA-Seq HVはA社キットより均一なカバレッジを示した。
Formalin compromised DNA（Horizon Discovery、Cat. No. HD803）とformalin-fixed paraffin-embedded DNA（Horizon Discovery、Cat. No. HD200）を用いて、ThruPLEX DNA-Seq HVおよびA社キットでライブラリーを3連で作製した。作製したライブラリーはAMPureビーズで精製・プール後、ヒトゲノムの800 kbをカバーするIDT社のxGEN Pan Cancer Panelでターゲット領域を濃縮した。NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2.5（150サイクル）を用いたペアエンドシーケンスを行い、各ライブラリーはtotal 500万リードにダウンサンプリングし、bowtie2を使用してhg19にアライメントした。バリアントコールにはVarDictを使用して、最小30×のカバレッジと0.5％以上のアレル頻度を含むように解析した。
Formalin compromised DNAを用いた場合はThruPLEX DNA-Seq HVの方が高いカバレッジを示し、formalin-fixed paraffin-embedded DNAの場合は、両キットにおいて同等の性能が示された。
Formalin compromised DNA（Horizon Discovery、Cat. No. HD803）とformalin-fixed paraffin-embedded DNA（Horizon Discovery、Cat. No. HD200）を用いて、ThruPLEX DNA-Seq HVおよびA社キットでライブラリーを3連で作製し、xGEN Pan Cancer Panel（IDT）を使用してターゲット遺伝子の濃縮を行った。3連のうち、少なくとも2連でバリアントを確実に検出された場合に、ポジティブバリアント検出とした。
いずれのインプット量、サンプルにおいても、ThruPLEX DNA-Seq HVはA社キットより多くの変異を検出した。
内容
ThruPLEX DNA-Seq HV（製品コード R400741/R400740）
ThruPLEX DNA-Seq HV PLUS Kit（製品コード R400782/R400783）
- ThruPLEX DNA-Seq HV Core Components（製品コード R400737/ R400736）
Control Fragmented Human gDNA (5 ng/μl)
PBD1
PED1
SBD1
SED1
ABD1
AED1
Nuclease-Free Water - ThruPLEX HV UDI 1-24 or Set A（製品コード R400739/R400738）
ThruPLEX DNA-Seq HV PLUS Kit（製品コード R400782/R400783）
- ThruPLEX DNA-Seq HV Core Components（製品コード R400737/R400736）
- ThruPLEX HV UDI 1-24 or Set A（製品コード R400739/R400738）
- ThruPLEX HV PLUS Enzymatic Fragmentation Module Set A
PEF1
PBF1
10×PDF1
Control Human gDNA (5 ng/μl)
Nuclease-Free Water
保存
－20℃
本製品以外に必要な試薬、機器（主なもの）
・サーマルサイクラー
・微量高速遠心機
・PCRチューブまたは 96-well PCRプレートとシール
・1.5 ml 低吸着遠心チューブ
・ピペットチップ
・80％ (v/v) エタノール
・PBS
・NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（製品コード 744970.5／.50／.500）またはAgencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, Cat. No. A63880)
・0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device（SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip：製品コード 635011）
・微量高速遠心機
・PCRチューブまたは 96-well PCRプレートとシール
・1.5 ml 低吸着遠心チューブ
・ピペットチップ
・80％ (v/v) エタノール
・PBS
・NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（製品コード 744970.5／.50／.500）またはAgencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, Cat. No. A63880)
・0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device（SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip：製品コード 635011）
Technical Notes
Improvements to the ThruPLEX® HV kits
ThruPLEX® HV PLUS kitsと他社同タイプキットとの比較
Streamlined DNA-seq from challenging samples
ThruPLEX® HV outperforms NEBNext Ultra II for DNA-seq of cell-free and FFPE DNA
ThruPLEX® HV：FFPEサンプルから再現性の高いデータ、cfDNAから低頻度変異の確実な検出を可能に（英語）
ThruPLEX® HV：FFPEサンプルおよびcfDNAを簡便かつ正確に実施可能なソリューション（英語）
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