ThruPLEX^® Tag-Seq HV

ThruPLEX Tag-Seq HVケミストリーは、最大30 μlのインプット量から、高い多様性と均一なGCカバレッジを備えたDNAライブラリーを作製するために最適化されている。
ライブラリー調製には、5～200 ngの断片化された二本鎖DNAを用いることが可能である。3ステップのワークフローは約2時間で、同一チューブまたは同一ウェルで行われ、操作途中の精製ステップやサンプルの移し替えは不要のため、取り扱いミスや貴重なサンプルの損失を防ぐことができる。ライブラリーの多様性が高いため、ThruPLEX Tag-Seq HVライブラリーは、ターゲット濃縮キットと組み合わせることができ、高品質のシーケンス結果を提供できる。
ThruPLEX Tag-Seq HVは個別の分子バーコード（UMI）を付加することにより、増幅およびシーケンスエラーの修正が可能であり、低頻度の変異を検出する際に有用である。本システムに含まれるUMIは均一な使用頻度になるように選択され、シーケンス結果において最も良い結果を提供できる。
ThruPLEX Tag-Seq HVのUMIは、一般公開されているツールを用いて解析できるよう設計されている。
Linuxなどのコマンド環境での解析方法のご紹介はこちら（Takara Bio USA社サイト）

ThruPLEX Tag-Seq HVとThruPLEX HV UDI（ユニークデュアルインデックス）を使用することにより、最大96個のライブラリーを混合できるように設計されている。精製および定量化されたライブラリーは、イルミナ社NGSに対応している。本キットはターゲット濃縮キットと組み合わせることにより、カバレッジの高いシーケンス結果を提供できる。血漿由来のセルフリーDNAやFFPEサンプルからの損傷DNAなどの断片化されたDNAでの使用に最適である。

ThruPLEX Tag-Seq HV PLUS Kitは、ThruPLEX Tag-Seq HVにThruPLEX HV PLUS Enzymatic Fragmentation Moduleが含まれた製品である。
ThruPLEX Tag-Seq HVのエンドリペアのステップと並行して、ThruPLEX HV PLUS Enzymatic Fragmentation Moduleに含まれる酵素により、サンプルDNAのサイズ調製可能な断片化を行うことが可能である。この製品により、機械的断片化や別の酵素による断片化を行っていた時間を省略することができる。

注意）ThruPLEX HV UDIは、ThruPLEX DNA-Seq、ThruPLEX Tag-Seq、ThruPLEX Plasma-Seq Kitなど、従来のバージョンのThruPLEX Kitとは互換性がありません。ThruPLEX「HV」キットとのみ互換性があります。
すべてのインデックスは、ベースコール用の2または4チャンネルケミストリーを使用するイルミナシーケンサーシステム（例：MiSeq、NovaSeq、MiniSeq、NextSeq、およびHiSeqプラットフォーム）で機能することが検証されています。1チャンネルケミストリーを使用するシステム（例：iSeq）では検証されていません。

ThruPLEX Tag-Seq HVのワークフローは、同一チューブ（または同一ウェル）で行われる3つの簡単なステップで構成されており、操作途中での精製ステップやサンプルの移し替えの必要がない。本キットは、高いインプット容量（30 μl）、最大200 ngまでのサンプルの使用が可能なため、サンプルの濃縮が不要で、多様性の高いライブラリーの作製が可能である。

PCRとシーケンスエラーに起因する偽陽性のコールを減らすことができ、バリアントコールのあいまいさを排除することができる。

Panel A．イルミナプラットフォームで高品質なシーケンスが確保できるUMIを選択
Panel B．50 ng（紫色）と5 ng（緑色）のDNAインプット量で、UMI使用頻度が均一に得られるように濃度を最適化

表1．UMIアルゴリズムを使用して同定されたバリアント
10 ngのQuan-Plex Patient-like ctDNA Reference Standard（AccuRef Diagnostics社、Cat. No. ARF-1003CT）と本キットを使用してライブラリーを作製後、xGen Pan Cancer Panel（IDT社）を使用してターゲット遺伝子を濃縮した。NextSeq500でシーケンス後、total 3,000万リードになるようにダウンサンプリングし、Bowtie2を使用してhg19にアライメントした。UMIの解析はfgbio toolを使用し、バリアントはVarDictを使用してコールされ、SnpEffによりアノテーションされた。各アレル頻度（0、1、5％）のサンプルのオンターゲット率は各々79％（データ示さず）であり、UMIによるターゲットのカバレッジは506-583（データ示さず）の範囲であった。アレル頻度1％、5％のサンプルでは予想された頻度の変異が検出され、0％のサンプルでは変異は検出されず、Quan-Plex Patient-like ctDNA Reference Standardで検証済み置換バリアントのみが検出された。

ThruPLEX Tag-Seq HV（製品コード R400742/R400743）

• ThruPLEX Tag-Seq HV Core Components（製品コード R400734/R400735）
  Control Fragmented Human gDNA (5 ng/μl)
  PBT1
  PET1
  SBT1
  SET1
  ABT1
  AET1
  Nuclease-Free Water
• ThruPLEX HV UDI 1-24 or Set A（製品コード R400739/R400738）

ThruPLEX DNA-Tag HV PLUS Kit（製品コード R400784/R400785）

• ThruPLEX Tag-Seq HV Core Components（製品コード R400734/R400735）
• ThruPLEX HV UDI 1-24 or Set A（製品コード R400739/R400738）
• ThruPLEX HV PLUS Enzymatic Fragmentation Module Set A
  PEF1
  PBF1
  10×PDF1
  Control Human gDNA (5 ng/μl)
  Nuclease-Free Water
  

－20℃

・サーマルサイクラー
・微量高速遠心機
・PCRチューブまたは 96-well PCRプレートとシール
・1.5 ml低吸着遠心チューブ
・ピペットチップ
・80％ (v/v) エタノール
・PBS
・NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（製品コード 744970.5／.50／.500）またはAgencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter社, Cat. No. A63880)
・0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device（SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip：製品コード 635011）