ThruPLEX^® DNA-Seq HV

ThruPLEX DNA-Seq HVワークフローは、同一チューブ(またはウェル)で行われる3つの簡単なステップで構成されており、操作途中での精製ステップやサンプルの移し替えの必要がない。本キットは、高いインプット容量（30 μl）、最大200 ngまでのサンプルの使用が可能なため、サンプルの濃縮が不要で、多様性の高いライブラリーの作製が可能である。

H. influenzae（インフルエンザ）51907D-5、E. coli（大腸菌）11303、またR.palustris（ロドプソドモナス）BAA-98D-5（ATCC）の各100、50、および5 ngを使用して、ThruPLEX DNA-Seq HVを用いてライブラリーを3連で作製した。AMPureビーズで精製後、NextSeq 150 Cycle Mid Output（2×75 bp）でペアエンドシーケンスを行った。正規化されたカバレッジは色付きの線で表され、各GC％で予想される100 bp領域の数は縦の線で表される。H. influenzaeゲノムのサイズは1.85 Mb、GC含有量は38％。大腸菌ゲノムのサイズは4.7 Mb、GC含有量は51％。R. palustrisゲノムのサイズは5.45 Mb、GC含有量は65％。
GC含量の異なるサンプルにおいても均一なGCカバレッジを示した。

HCT116、RKO、およびSW48細胞からプールされたgDNA（Horizon Discovery）の5 ngおよび50 ngを使用してライブラリーを3連で作製した。ライブラリーは、ThruPLEX DNA-Seq HV（ThruPLEX HV）またはA社キットのプロトコールに従った。ペアエンドシーケンスは、NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2.5（150サイクル）で行い、リード数はtotal 800万リードにダウンサンプリングした。縦の灰色のバーは、100 bp windowsを用いて予想されるGC含量分布を表している。 ThruPLEX DNA-Seq HVはA社キットより均一なカバレッジを示した。

Formalin compromised DNA（Horizon Discovery、Cat. No. HD803）とformalin-fixed paraffin-embedded DNA（Horizon Discovery、Cat. No. HD200）を用いて、ThruPLEX DNA-Seq HVおよびA社キットでライブラリーを3連で作製した。作製したライブラリーはAMPureビーズで精製・プール後、ヒトゲノムの800 kbをカバーするIDT社のxGEN Pan Cancer Panelでターゲット領域を濃縮した。NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2.5（150サイクル）を用いたペアエンドシーケンスを行い、各ライブラリーはtotal 500万リードにダウンサンプリングし、bowtie2を使用してhg19にアライメントした。バリアントコールにはVarDictを使用して、最小30×のカバレッジと0.5％以上のアレル頻度を含むように解析した。
Formalin compromised DNAを用いた場合はThruPLEX DNA-Seq HVの方が高いカバレッジを示し、formalin-fixed paraffin-embedded DNAの場合は、両キットにおいて同等の性能が示された。

Formalin compromised DNA（Horizon Discovery、Cat. No. HD803）とformalin-fixed paraffin-embedded DNA（Horizon Discovery、Cat. No. HD200）を用いて、ThruPLEX DNA-Seq HVおよびA社キットでライブラリーを3連で作製し、xGEN Pan Cancer Panel（IDT）を使用してターゲット遺伝子の濃縮を行った。3連のうち、少なくとも2連でバリアントを確実に検出された場合に、ポジティブバリアント検出とした。
いずれのインプット量、サンプルにおいても、ThruPLEX DNA-Seq HVはA社キットより多くの変異を検出した。