NGSライブラリーの精製、サイズ分画に
- 磁性ビーズを用いたNGSライブラリーの精製、サイズ分画
- 少量（17.5 pg）サンプルから利用可能
- 150～800 bpのサイズ分画が可能
- さまざまなNGS applicationに容易に対応
- 手動と自動化装置のどちらにも対応
製品説明
NucleoMag NGS Clean-up and Size Selectは、NGSライブラリー作製において、1回または2回のサイズ分画によりDNA断片を精製すると同時に目的サイズのDNA断片を回収するためのキットである。本製品の磁性ビーズは、結合バッファーに懸濁されており、目的のDNA断片サイズに合わせて希釈率を調整して使用する。希釈率は一般的に使用される精製用のビーズを使用する場合と大きな違いはなく、NGSライブラリー調製キットのプロトコールに容易に組み込むことが可能である。
図1．DNA断片のサイズ選択
より大きなサイズまたは小さいサイズのDNAのどちらかを除去するサイズ分画では、サンプルをあらかじめ定めた比率でビーズと混合する（混合比率とサイズ分画のだいたいの大きさは下図参照）。より大きなサイズと小さいサイズの断片をカットオフする、特定サイズ領域のみのDNA分画の場合は異なった混合比率での2回の結合ステップを含む精製を行う。
図2．さまざまなサイズ断片の回収率
DNAサイズ分画のため、各100 μl DNA溶液 (10 ng/μl)に図に示される比率（ratio＝ビーズ：DNA）となるようにNucleoMag NGS Clean-up and Size Selectビーズを加えて精製を行い、各DNA断片の回収率を算出した。DNAは、100～1,000 bpサイズの混合物を使用した。
図3．両側サイズ選択
マウス組織由来のゲノムDNAを断片化後、違った比率のNucleoMag NGS Clean-up and Size Selectを使用してサイズ分画を行った。
緑：断片化DNAのサイズ分布
赤：ビーズ比率が0.4と0.6でのサイズ分画後のライブラリーサイズ分布（平均サイズ：460 bp）
青：ビーズ比率が0.55と0.8でのサイズ分画後のライブラリーサイズ分布（平均サイズ：340 bp）
図4．短鎖DNAの除去
100～1,000 bpサイズのDNA混合物をアダプターダイマー除去のプロトコールに従ってサイズ分画を行い精製した。100～200 bpの大きさのDNA断片が取り除かれていることが示された。
図5．NGSライブラリーからのサイズ分画
大腸菌DNAをサンプルに、TruSeq DNA PCR Free kit（Illumina社）を用いてNGS用のライブラリーを作製した。その際、DNA精製とサイズ分画は、A社磁性ビーズ（赤）、B社磁性ビーズ（青）、NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（緑）を使用した。図Aは、精製前の断片化E. coli DNA（1 μg）を示す。図Bは、ライブラリー調製後のDNA断片の分布を示す。
図6．サイズ分画後のシーケンス解析
図5で作製されたライブラリーを用いて実際に塩基配列解析を行い、各磁性ビーズ精製で塩基配列結果を比較した。塩基配列解析はTruSeq Rapid SBS Kit（Illumina社）を用いて、HiSeq2500で解析を行った。
A．得られた塩基配列を大腸菌ゲノムにマッピングを行い、各塩基の解析数（depth）を比較した。3つの磁性ビーズで、グラフの形状はほぼ一致しており、ゲノム全体で解析結果に差は見られなかった。
B．塩基配列解析のGC比率の影響を確認するため、横軸にGCの比率、縦軸に各ビーズ精製のライブラリー由来のread depthの比率をプロットした。3つの精製ビーズで、GCによるバイアスの違いは見られなかった。
| 原理 | 磁性ビーズ法 |
| 形状 | 高反応性超常磁性ビーズ |
| 操作 | 手動または自動化装置 |
| サンプル種 | NGSライブラリーの作製途中の反応液 |
| サンプル量 | 17.5 pg～5 μg |
| サンプル液量 | 50～150 μl |
| 回収量 | ＞80％ |
| 溶出液量 | 10～100 μl |
図1．DNA断片のサイズ選択
より大きなサイズまたは小さいサイズのDNAのどちらかを除去するサイズ分画では、サンプルをあらかじめ定めた比率でビーズと混合する（混合比率とサイズ分画のだいたいの大きさは下図参照）。より大きなサイズと小さいサイズの断片をカットオフする、特定サイズ領域のみのDNA分画の場合は異なった混合比率での2回の結合ステップを含む精製を行う。
図2．さまざまなサイズ断片の回収率
DNAサイズ分画のため、各100 μl DNA溶液 (10 ng/μl)に図に示される比率（ratio＝ビーズ：DNA）となるようにNucleoMag NGS Clean-up and Size Selectビーズを加えて精製を行い、各DNA断片の回収率を算出した。DNAは、100～1,000 bpサイズの混合物を使用した。
図3．両側サイズ選択
マウス組織由来のゲノムDNAを断片化後、違った比率のNucleoMag NGS Clean-up and Size Selectを使用してサイズ分画を行った。
緑：断片化DNAのサイズ分布
赤：ビーズ比率が0.4と0.6でのサイズ分画後のライブラリーサイズ分布（平均サイズ：460 bp）
青：ビーズ比率が0.55と0.8でのサイズ分画後のライブラリーサイズ分布（平均サイズ：340 bp）
図4．短鎖DNAの除去
100～1,000 bpサイズのDNA混合物をアダプターダイマー除去のプロトコールに従ってサイズ分画を行い精製した。100～200 bpの大きさのDNA断片が取り除かれていることが示された。
図5．NGSライブラリーからのサイズ分画
大腸菌DNAをサンプルに、TruSeq DNA PCR Free kit（Illumina社）を用いてNGS用のライブラリーを作製した。その際、DNA精製とサイズ分画は、A社磁性ビーズ（赤）、B社磁性ビーズ（青）、NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（緑）を使用した。図Aは、精製前の断片化E. coli DNA（1 μg）を示す。図Bは、ライブラリー調製後のDNA断片の分布を示す。
図6．サイズ分画後のシーケンス解析
図5で作製されたライブラリーを用いて実際に塩基配列解析を行い、各磁性ビーズ精製で塩基配列結果を比較した。塩基配列解析はTruSeq Rapid SBS Kit（Illumina社）を用いて、HiSeq2500で解析を行った。
A．得られた塩基配列を大腸菌ゲノムにマッピングを行い、各塩基の解析数（depth）を比較した。3つの磁性ビーズで、グラフの形状はほぼ一致しており、ゲノム全体で解析結果に差は見られなかった。
B．塩基配列解析のGC比率の影響を確認するため、横軸にGCの比率、縦軸に各ビーズ精製のライブラリー由来のread depthの比率をプロットした。3つの精製ビーズで、GCによるバイアスの違いは見られなかった。
内容
・NucleoMag NGS Bead Suspension
本製品以外に必要な試薬、機器（主なもの）
・80％エタノール
・Elution buffer（10 mM Tris-HCl（pH 8）またはH2O）
・ピペットチップ（滅菌済）
・ピペット
・磁気ビーズセパレーター
NucleoMag SEP（製品コード 744900）
・磁気ビーズの分離用プレート
96-well 0.3 mL microtiterplate（Elution Plate U-bottom; 製品コード 740486.24）
・プレートシール
Self-adhering PE Foil（製品コード 740676）
・Elution buffer（10 mM Tris-HCl（pH 8）またはH2O）
・ピペットチップ（滅菌済）
・ピペット
・磁気ビーズセパレーター
NucleoMag SEP（製品コード 744900）
・磁気ビーズの分離用プレート
96-well 0.3 mL microtiterplate（Elution Plate U-bottom; 製品コード 740486.24）
・プレートシール
Self-adhering PE Foil（製品コード 740676）
保存
4℃
操作手順
2回のサイズ分画による特定サイズのDNAの精製
* 磁性ビーズ溶液と試料の混合比率（0.4 or 0.6）については、分画したいDNAの大きさや試料の組成に応じて適切に設定してください。
* 磁性ビーズ溶液と試料の混合比率（0.4 or 0.6）については、分画したいDNAの大きさや試料の組成に応じて適切に設定してください。
用途
- NGSライブラリーキットにおける精製やサイズ分画
- 次世代シーケンスのサンプル調製
NucleoMagはマッハライ・ナーゲル社の登録商標です。
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- 注意事項
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