Guide-it™ SNP Screening Kit

本図ではGからAへの塩基置換の検出例を示す。
ゲノム編集後、FACSか限界希釈法によりシングルセルクローニングを行い、増殖する。DNA抽出した後、ゲノム編集部位を含む領域をPCR増幅し、PCR産物（青部分）を2種類の相補オリゴDNA、displacement oligo（緑部分）とflap-probe oligo（紫部分）、とハイブリダイズする。flap-probe oligoにはフラップを形成する配列固定の非相補配列（薄紫部分）を付加している。この2種類のオリゴDNAがPCR産物とハイブリダイズすると、ゲノム編集結果によって2種類の構造を形成する。
ゲノム編集で変異が導入できたDNAでは、flap-probe oligoは変異部位で完全な塩基対を形成し、double-flap構造を生じる（フロー下）。Guide-it-Flapaseはdouble-flap構造を認識して切断する特異的ヌクレアーゼである。Guide-it-Flapase切断の結果で生じたフラップはGuide-it Flap Detectorにより認識され、蛍光シグナルを発する。
ゲノム編集で変異が導入されていないDNAでは、flap-probe oligoは変異サイトで完全な塩基対を形成せずギャップがあるため、Guide-it Flapaseによって切断されない（フロー上）。このようにGuide-it SNP Screening Kitで蛍光シグナルを検出することにより、塩基置換が起こっているかどうかを調べることができる。

ホモ、ヘテロ、野生型の塩基置換を示す細胞を使用してSNPスクリーニングを行った。各ケースにおいて、ホモとヘテロサンプルで、十分に高い蛍光シグナルが得られた。

コーリエル医学研究所から得られた、NCP1 またはCFTR遺伝子にSNPを有する細胞をGuide-it SNP Screening KitとサンガーシーケンスによりSNP解析した。パネルAでは、2種類のflap-probe oligoを作製し、A＞G置換でのAとGを別々にアッセイし、ホモかヘテロかを決定した。パネルBでは、T＞A置換において、野生型かホモかを解析した。全ての結果は、サンガーシーケンスの結果（図3下）と一致した。

コーリエル医学研究所から得られたゲノムDNAを解析した。各ゲノムDNAは各遺伝子座で野生型かホモ接合型である。野生型（赤色）やネガティブコントロール（灰色）で得られた蛍光シグナルと比較して各塩基置換がホモ接合型のサンプル（青色）では、全ての置換において、明らかに強いシグナルを示した。