ブレビバチルス分泌発現システム

• 大量のタンパク質を菌体外に分泌生産する。
• プロテアーゼ活性をほとんど示さない。
• 活性型のタンパク質を生産する。
• 培養、滅菌が容易
• 遺伝子操作が簡単
• 安全な宿主

本宿主は形質転換効率が高いため、遺伝子操作を簡単に行うことが出来る。大腸菌とのシャトルベクターを用いて、発現ベクターを大腸菌内で構築する方法や、ライゲーションDNAを直接、発現宿主に導入することも可能である。System IIでは形質転換に特別な装置を必要としないBrevibacillus Competent Cellsを使用する。
形質転換体コロニーを選択し、試験管やフラスコを用いて振とう培養を行い、培養上清を遠心分離によって回収することにより、簡単に目的タンパク質を得ることができる。菌体の破砕工程などが必要ないため、遠心による除菌操作により清澄な上清画分から目的タンパク質が得られ、後の精製工程に有利である。

• 発現ベクター
  pNY326 DNA 10 μg（200 ng/μl）（製品コード HB111：終売）
  pNCMO2 DNA 10 μg（200 ng/μl）（製品コード HB112：終売）
• コントロールベクター
  pNY326-BLA DNA 1 μg（製品コード HB114：終売）
• コンピテントセル
  Brevibacillus Competent Cells（製品コード HB116：終売）
  　　・Brevibacillus Competent Cells（100 μl×10）
  　　・MT medium（1 ml×10）
  　　・Solution A（1 ml）
  　　・Solution B（1 ml×2）

1. 発現ベクターの選択
   

   （1）pNCMO2 DNA

   pNCMO2はBrevibacillusと大腸菌のシャトルベクターである。そのため、大腸菌内で発現プラスミドを構築後、Brevibacillusに導入し、発現試験に進むことができる。pNCMO2の発現プロモーターには宿主菌の細胞壁タンパク質由来のP2プロモーターを用いている。P2プロモーターは大腸菌内では働かないため、目的遺伝子のクローニングに有利である。しかし、Brevibacillusにおいては非常に強いプロモーターとして働く。従って、Brevibacillusでの効率的なタンパク質生産を行うことができる。
   
   

   注：	P2プロモーターの強力なプロモーター活性が、形質転換体の生育を妨げてしまう場合がある。そのような場合は、pNY326ベクターの使用を検討する。

   
   

   図1. pNCMO2 DNA ベクターマップ

   プライマーの設計 ↓ PCRによる目的遺伝子の増幅・ pNCMO2のE. coliでのクローニング ↓ シーケンスの確認 ↓ B. choshinensisへの形質転換 ↓ タンパク質発現試験

   
   
   

   （2）pNY326 DNA

   pNY326はBrevibacillus内で複製するプラスミドで、大きさが3.4 kbと比較的小さく、pNCMO2よりもプロモーター活性は弱めであるため、宿主内で非常に安定に保たれ、発現産物が宿主に対してストレスとなる場合には効果的である。このベクターを用いることにより、良好な生育を示し、生産量が向上する場合もある。植え継ぎ等による生産量の変動が少ないため、ラージスケールでの培養に適している。Brevibacillus専用ベクターである為、宿主菌を用いて直接クローニングをする必要がある。
   高い形質転換効率が要求される為、高効率が得られるコンピテントセル（Brevibacillus Competent Cells）（10⁵ transformants/μg DNA) の利用を推奨する。
   
   

   図2. pNY326 DNA ベクターマップ

   プライマーの設計 ↓ PCR による目的遺伝子の増幅・ pNY326のB. choshinensisでのクローニング ↓ シーケンスの確認 ↓ タンパク質発現試験




2. 発現ベクターへのクローニング
   発現ベクターには細胞壁タンパク質由来の分泌シグナルを採用している。分泌シグナルの切断部位の下流に目的遺伝子を挿入するように設計する。シグナルペプチド上および、その下流のマルチクローニングサイト上の2種類の制限酵素部位を用いることによって、インサートを目的の方向にクローニングできる。
   
   
   図3. B. choshinensis発現ベクターの構築
   



3. Brevibacillusの形質転換
   Brevibacillusの形質転換はNTP法（New Tris-PEG法）によって行う。選択はネオマイシン耐性によって行う。シャトルベクターを用いて大腸菌でサブクローニングする場合は、アンピシリン耐性によって選択できる。



4. タンパク質生産の確認とスケールアップ
   ネガティブコントロールとポジティブコントロール（pNY326-BLA： Bacillus licheniformis由来α-アミラーゼ）を用い、目的タンパク質の発現を確認する。目的タンパク質発現プラスミドを導入した形質転換体をピックアップし、指定の液体培地で振とう培養することにより、48～64時間で目的のタンパク質が得られる。培養上清をSDS-PAGE等で解析することにより、発現の有無が確認できる。生産量を上げるためには、スケールアップを行う。Brevibacillusのラージスケールでの培養は比較的容易である。