Cycleave RT-PCR Cryptosporidium (18S rRNA) Detection Kit

クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）は胞子虫類に属する原虫で、環境中では「オーシスト」と呼ばれる嚢包（のうほう）体の形（大きさは4～6 μm）で存在し、ヒトや動物（ウシ、ブタ、ネコ、イヌなど）の消化管の細胞に寄生することにより増殖し、激しい下痢症状を呈する。感染性を持ったオ－シストが糞便中に大量に排出され、それにより汚染された食品や飲料水を介してヒトに経口感染する。オ－シストは、水中では冷蔵で数ヵ月程度の生存が可能であり、塩素に対してもきわめて強い耐性がある。わが国では、クリプトスポリジウム感染症は5類感染症に分類され、厚生労働省は「水道におけるクリプトスポリジウム等対策指針」を策定し、原水の安全性確認としてクリプトスポリジウム等および指標菌の検査が行われている。クリプトスポリジウムは人工培地で培養できないことから、検出方法として、蛍光顕微鏡により蛍光抗体染色したオーシストを観察する方法で原虫の確認が行われているが、高度な技術と経験が必要とされている。

本キットは、クリプトスポリジウム属18S rRNA遺伝子をターゲットとして、ゲノムDNA上の遺伝子に加え、クリプトスポリジウム由来RNAを逆転写したcDNAも検出する。ゲノムDNAに対してRNAはコピー数が多いことが知られており、RNAを対象としたリアルタイムPCR法（リアルタイムRT-PCR法）により、微量のクリプトスポリジウムを検出できる。リアルタイムPCR法は、簡便性、迅速性、反応特異性の高さから、近年、環境衛生管理において急速に普及している。クリプトスポリジウム感染症への対策においても、有効活用されることが期待されている。

本キットの増幅反応には、Hot Start PCR用酵素のTaKaRa Ex Taq Hot Start Versionを使用しており、反応液調製時などサイクル前のミスプライミングやプライマーダイマーに由来する非特異的増幅を抑制しながら高感度の検出が可能である。増幅産物の検出にはサイクリングプローブ法を採用している。この方法はRNAとDNAからなるキメラプローブとRNase Hの組み合わせによる高感度な検出方法で、非常に特異性の高い検出が可能である。
本製品には、クリプトスポリジウム属18S rRNA遺伝子を検出するためのFAM標識プローブ、インターナルコントロールDNAとインターナルコントロール検出用のROX標識プローブが含まれており、二波長を同時にモニタリングすることで、1本のチューブでクリプトスポリジウム遺伝子の検出とインターナルコントロールDNAの検出による偽陰性の確認試験が可能である。
Crypto. Positive Control を用いて検量線を作成することで、サンプル中に含まれるクリプトスポリジウムの定量も可能である。

詳しくはこちらをご覧ください。

（50回反応分、25 μl反応系）

●	1.	5×PrimeScript RT Master Mix	5×conc.	100 μl
●	2.	2×Cycleave Reaction Mixture	2×conc.	625 μl
●	3.	Crypto. Primer/Probe Mix（FAM, ROX）*1	5×conc.	250 μl
○	4.	RNase Free dH2O		1 ml
●	5.	Lysis Buffer		625 μl×4
○	6.	Proteinase K	20 mg/ml	50 μl
○	7.	dH2O（for Dilution）		150 μl
●	8.	Crypto. Positive Control*2	1×105 copies/μl	50 μl
●	9.	EASY Dilution (for Real Time PCR)		1 ml×2

*1 蛍光標識プローブを含んでいるので、遮光すること。
*2 リアルタイムPCRコンポーネント（1～4）に誤って混入すると、正しい検出反応 を行うことができなくなる。
　　開封後は、PCRコンポーネント（1～4）を付属のキットケースに移し、別に保存すること。

－20℃

本製品で使用しているCrypto. Primer/Probe Mixの配列情報からは、以下の菌種が検出可能である。

• Cryptosporidium parvum (C. parvum)
• C. hominis
• C. meleagridis
• C. canis
• C. felis
• C. muris
• C. andersoni
• C. baileyi
• C. bovis
• C. wrairi

Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズ「食品環境検査用ソフトウェア」を使用の場合に便利な“Quick Manual”を用意している。
キットに添付の取扱説明書とあわせて使用する。
CycleavePCRキットによる定性解析（PDF、989 K） 定量解析（絶対定量モード）用（PDF、993 K） リアルタイムPCRによるクリプトスポリジウム、ジアルジア検出（PDF、1.12 MB）

---

遺伝子検出・検査　関連試薬の選択フローをご利用ください

分野別の試薬選択フロー
手法別の試薬選択フロー

「遺伝子検査（食品・水質・家畜他）」関連のお役立ち情報専用ページもご参照ください。