アクセサリータンパクを添加した最上級の逆転写酵素
反応用バッファー添付
製品説明
本製品は、卓越したプライマー利用効率と合成スピードを有するPrimeScript RTaseと、cDNA合成の妨げとなるRNAの高次構造を解消し、逆転写プライマーのミスプライミングを抑制するアクセサリータンパク質により、RNA分解の恐れの小さい標準的な反応温度（42℃）で、バックグラウンドの少ない高品質なcDNA合成を達成する最上級の逆転写酵素である。また、アクセサリータンパク質により、氷上における逆転写酵素の非特異的伸長反応が完全に抑制されているため、反応液調製後、逆転写反応するまでに時間を要しても長鎖のcDNA合成の阻害は起こらない。合成されたcDNAは2nd-strand合成、ハイブリダイゼーション、エンドポイントPCRやリアルタイムPCRに幅広く利用でき、特に完全長cDNAライブラリーの作製など、高品質なcDNAが必要なアプリケーションに適している。
保存
－20℃
性能紹介
PrimeScript II RTaseはPrimeScriptを超えた最高品質の長鎖cDNA合成が可能である。
【polyAからの長鎖cDNA合成がどれだけ優れているか？】
ヒト心臓由来total RNA 1 μgを鋳型にOligo dT Primer を用いてcDNA合成を行い、
Dystrophin遺伝子のpolyA近傍から6,930塩基の長鎖のcDNA量をリアルタイムPCRにより定量した。
PrimeScript II RTaseはPrimeScript RTaseやA社酵素を上回る伸長性を示し、
短時間の逆転写反応においても優れたcDNA合成能を有することが確認できた。
【polyAからの長鎖cDNA合成が氷上放置によりどの程度阻害されるか？】
ヒト心臓由来total RNA 1 μgを鋳型にOligo dT Primer を用いてcDNA合成を行うための反応液を調整し、
0～30分間氷上に放置した後、逆転写反応を行い、95℃まで加熱して反応を停止した。
この反応液を鋳型として、Dystrophin遺伝子の6,930塩基についてリアルタイムPCRで定量した。
PrimeScript II RTaseは反応液の氷上放置が長くなっても非特異的伸長産物が増加せず、
その後の逆転写反応においても長鎖cDNA合成の阻害は全く見られなかった。
濃度
200 U/μl
形状
| 20 mM | Tris-HCl, pH7.8 |
| 100 mM | NaCl |
| 1 mM | EDTA |
| 1 mM | DTT |
| 1％ | Tween 20 (v/v) |
| 50％ | Glycerol (v/v) |
添付試薬組成（保存：－20℃）
5×PrimeScript ll Buffer（cDNA合成用）
| 250 mM | Tris-HCl, pH8.3 |
| 375 mM | KCl |
| 15 mM | MgCl2 |
活性の定義
Poly(rA) oligo(dT)12-18を鋳型／ プライマーとして、37℃、10 分間に1 nmolの[3H] dTTPを取り込む酵素活性を1 Uとする。
活性測定用反応液組成
| 50 mM | Tris-HCl, pH 8.3 |
| 75 mM | KCl |
| 8 mM | MgCl2 |
| 10 mM | DTT |
| 20 μg/ml | (rA)n･(dT)12-18 |
| 0.5 mM | [3H]dTTP |
| 0.1％ | NP-40 |
1st-strand cDNA 合成試験
標準プロトコールに従って、Mouse心臓由来のtotal RNA 250 ngを鋳型とし、Oligo dT Primer 50 pmolおよび本酵素200 Uを用いて42℃で30分間1st-strand cDNA合成反応を行った。続いてこのcDNA反応液を鋳型としてPCRを行い、アガロースゲル電気泳動によって13 kbの増幅産物を確認した。
起源
組換え体大腸菌で発現、分離精製
用途
- 1st-strand cDNA合成
- cDNAプローブ調製
- RT-PCR
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