Tet-One™発現誘導システム

Tet-OneシステムはTet-On 3Gトランスアクチベーターとテトラサイクリン応答因子配列（PTRE3GS）を同一ベクターに搭載したAll-in-Oneベクターの遺伝子発現制御システムである。従来のTetシステムではこれらが別々のベクターに搭載されているため、2種類のベクターを安定に保持する株の樹立に大きな労力と時間が必要である。Tet-Oneシステムはこれら因子を1つのベクターに搭載したAll-in-Oneベクターであり、1回の形質転換で目的の遺伝子発現制御株が得られる。
Tet-Oneシステムのベクターでは、Tet-On 3Gトランスアクチベーターはヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターから正方向に、P_TRE3GSプロモーターから目的遺伝子が逆方向に転写される。文献等の従来型のAll-in-Oneベクターの遺伝子発現誘導倍率は約50～100倍であったが、Tet-Oneシステムでは～25,000倍の誘導倍率が得られる。
システムとして、プラスミドベクター型のTet-One Inducible Expression Systemとレトロウイルスベクター型のRetro-X Tet-One Inducible Expression Systemがあり、レトロウイルスベクター型には薬剤選択マーカーとしてpuromycinを持つRetro-X Tet-One Inducible Expression System (Puro)がある。
さらに、アデノ随伴ウイルス（AAV）タイプのAAVpro Tet-One Inducible Expression System (AAV2)がある。
ヘルパーウイルスを使用せずにAAVベクターを作製でき、AAVウイルスを簡便に調製できる抽出試薬も含まれる。


図1. Tet-One Systemの誘導発現原理
ヒトPGKプロモーターにより、Tet-On 3Gトランスアクチベーターは構成的に発現されるが、ドキシサイクリンの非存在下ではTRE 3Gプロモーター（P_TRE3GS）に結合できない。培養液中にドキシサイクリンが添加されると、トランスアクチベーターが構造変化し、P_TRE3GSに結合し、P_TRE3GS下流にクローニングした目的遺伝子の転写を活性化する。


図2. RetroX-TetOne-Luc retrovirusを用いたLuciferase遺伝子の発現誘導
293TおよびHepG2細胞にRetroX-TetOne-LucをMOI=1で感染させた。形質導入済み細胞プールをDox処理有りまたは無しで48時間培養後、ルシフェラーゼアッセイを行った。ヘテロな形質導入済み細胞プールにおいても高い誘導倍率が得られた。
RLU＝relative light units


図3. pTetOne-Luc control plasmidをトランスフェクションした293T細胞における一過性ルシフェラーゼ発現誘導
293T細胞にpTetOne-Luc control plasmidをトランスフェクションし、培養24時間後に10倍段階希釈したドキシサイクリンを添加しルシフェラーゼを誘導した後、ルシフェラーゼアッセイを行った。一過性発現においても1,000倍以上の誘導倍率が観察された。

図4．pTetOne ベクターマップとMCS（Tet-One Inducible Expression System）



図5．Retro-X Tet-Oneベクターマップ（Retro-X Tet-One Inducible Expression System）
2種類のベクターの違いは、pRetroX-TetOne-Puroには導入安定株選択のためのpuromycin耐性遺伝子が搭載されている。pRetro-TetOneには、薬剤耐性遺伝子を含まないため、より大きな遺伝子をクローニングできる（pRetro-TetOne；～3.1 kb. pRetroX-TetOne-Puro; ～2.1 kb）。しかし、pRetro-TetOneを使用した場合、限界希釈法により形質導入クローンを得る必要がある。

Tet-One Inducible Expression System（製品コード 634301）

• pTetOne Vector Set
  　　pTetOne Vector
  　　pTetOne-Luc Control Vector
  　　Linear Hygromycin Marker
  　　Linear Puromycin Marker
• Xfect Transfection Reagent（製品コード 631317）　100反応分
  　　Xfect Polymer
  　　Xfect Reaction Buffer
• Tet System Approved FBS, US-Sourced （製品コード 631105）　50 ml

Retro-X Tet-One Inducible Expression System（製品コード 634304）

• pRetroX-TetOne Vector Set
  　　pRetroX-TetOne Vector
  　　pRetroX-TetOne-Luc Control Vector
• Retro-X Universal Packaging Vector Set
  　　p10A1 Vector
  　　pAmpho Vector
  　　pEco Vector
  　　pVSV-G Vector
  　　pQCLIN Retroviral Vector
• GP2-293 Packaging Cell Line（2×10⁶ cells/ml）
• Xfect Transfection Reagent（製品コード 631317）
  　　Xfect Polymer
  　　Xfect Reaction Buffer
• Tet System Approved FBS, US-Sourced （製品コード 631105）　50 ml

Retro-X Tet-One Inducible Expression System (Puro)（製品コード 634307）

• pRetroX-TetOne-Puro Vector Set
  　　pRetroX-TetOne-Puro Vector
  　　pRetroX-TetOne-Puro-Luc Control Vector
• Retro-X Universal Packaging Vector Set
  　　p10A1 Vector
  　　pAmpho Vector
  　　pEco Vector
  　　pVSV-G Vector
  　　pQCLIN Retroviral Vector
• GP2-293 Packaging Cell Line (2×10⁶ cells/ml）
• Xfect Transfection Reagent (製品コード 631317）
  　　Xfect Polymer
  　　Xfect Reaction Buffer
• Tet System Approved FBS, US-Sourced (製品コード 631105）　50 ml

AAVpro Tet-One Inducible Expression System (製品コード 634310)

• AAVpro Tet-One Vector Set
  　　pAAV-TetOne Vector
  　　pAAV-TetOne-Luc Control Vector
• pRC2-mi342 Vector
• pHelper Vector
• AAVpro Extraction Solution
  　　AAV Extraction Solution A
  　　AAV Extraction Solution B
  

注意）
本製品に含まれるTetOneベクターは、プラスミド調製した際の収量が、一般的なプラスミドよりかなり低くなります。収量を上げるために、培養液量を増やして調製していただくことをお勧めします。
市販のプラスミド調製用キットをご使用の場合は、低コピープラスミド用のプロトコールに従って調製してください。

Tet-One Inducible Expression System（製品コード 634301）、AAVpro Tet-One Inducible Expression System (製品コード 634310)：－20℃保存

Retro-X Tet-One Inducible Expression System（製品コード 634304）およびRetro-X Tet-One Inducible Expression System (Puro)（製品コード 634307）： GP2-293 Packaging Cell Lineは液体窒素保存。その他は－20℃保存