cDNAライブラリー構築のオールインワンキット
製品説明
真核生物の様々な組織や細胞より調製したpolyA+ RNAからcDNAを合成しクローニングを行う操作は、分子生物学的研究における重要な手法の一つとして頻繁に実施されており、この技術によって遺伝子の構造解析や目的のタンパク質の発現操作が容易に行えるようになった。
一般的に、cDNA合成とそのライブラリーは、目的のpolyA+ RNAに相補的な二本鎖cDNAを合成してバクテリアやウイルス由来のベクターに組み込んだ後、このcDNA組換え体をバクテリアあるいは真核細胞に導入し複製してcDNAを増幅させ、cDNAの解析を行うためや、更にin vitro transcriptionやin vitro translation等を行うために利用される。
本製品は、主に動植物由来のpolyA+ RNAから二本鎖cDNAを合成し、キット添付のpAP3neoなどのプラスミドベクターへ組み込むことによりcDNAライブラリーを構築するためのキットである。cDNAライブラリーの構築には、Gubler-Hoffmanの方法に基づいたリンカープライマー法を使用しており、遺伝子の方向性を維持するDirectional cloningが可能である。
一般的に、cDNA合成とそのライブラリーは、目的のpolyA+ RNAに相補的な二本鎖cDNAを合成してバクテリアやウイルス由来のベクターに組み込んだ後、このcDNA組換え体をバクテリアあるいは真核細胞に導入し複製してcDNAを増幅させ、cDNAの解析を行うためや、更にin vitro transcriptionやin vitro translation等を行うために利用される。
本製品は、主に動植物由来のpolyA+ RNAから二本鎖cDNAを合成し、キット添付のpAP3neoなどのプラスミドベクターへ組み込むことによりcDNAライブラリーを構築するためのキットである。cDNAライブラリーの構築には、Gubler-Hoffmanの方法に基づいたリンカープライマー法を使用しており、遺伝子の方向性を維持するDirectional cloningが可能である。
内容
（5回構築分）
| 1. | PrimeScript RTase (200 U/μl) | 5 μl |
| 2. | RNase Inhibitor（40 U/μl） | 5 μl |
| 3. | Oligo (dT) 18 Anchor Primer（1 μg/μl）*1 | 10 μl |
| 4. | 5×1st Strand Synthesis Buffer*2 | 20 μl |
| 5. | 1st Strand dNTP Mixture | 6 μl |
| 6. | E. coli RNase H/E. coli DNA Ligase Mixture | 10 μl |
| 7. | E. coli DNA Polymerase I（20 U/μl） | 10 μl |
| 8. | 2nd Strand dNTP Mixture*2 | 23 μl |
| 9. | 5×2nd Strand Synthesis Buffer*2 | 150 μl |
| 10. | T4 DNA Polymerase（1 U/μl） | 20 μl |
| 11. | 10×T4 DNA Ligase Buffer | 20 μl |
| 12. | T4 DNA Ligase（350 U/μl） | 20 μl |
| 13. | EcoR I-Sma I Adaptor（0.4 μg/μl） | 18 μl |
| 14. | Not I Supplement | 135 μl |
| 15. | Not I（50 U/μl） | 15 μl |
| 16. | tRNA (10 μg/μl) | 5 μl |
| 17. | Dr. GenTLE Precipitation Carrier*3 | 60 μl |
| 18. | 3 M Sodium Acetate（pH5.2） | 1 ml |
| 19. | pAP3neo Predigested Vector（100 ng/μl）*4 | 5 μl |
| 20. | RNase-free H2O | 640 μl |
| 21. | Control RNA（1 μg/μl）*5 | 5 μl |
| 22. | T7 promotor primer*6（5 pmol/μl） | 20 μl |
| 23. | T3 promotor primer (for pAP3neo)*6（5 pmol/μl） | 20 μl |
| Spin Column | 5本 | |
*1 Oligo (dT)18 Anchor Primerには、Not Iサイトの他にXho Iサイトも付加されています（配列情報参照) 。Not IではなくXho I消化を行うことで、EcoR I - Xho Iフラグメントとして二本鎖cDNAを調製することも可能ですので、これらのサイトを利用したベクター (脱リン酸化されたものは不可）でのcDNAライブラリー構築にも使用できます。なお、本キットにはXho I消化用の酵素などは含まれていませんので、別途用意してください。
*2 PrimeScript Double Strand cDNA Synthesis Kit（製品コード 6111A）に含まれるものとは組成が異なります。
*3 Genとるくんエタ沈キャリア（製品コード 9094）と同じものです。
*4 EcoR I, Not Iで切断済みです。
*5 本キットに添付されているControl RNAは、SP6 promoter領域の下流にpBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を含む約1.4 kbの断片を挿入したプラスミドpSPTet3を鋳型にして、SP6 RNA Polymeraseを用いてin vitro transcriptionにより合成したものです。本キットには1反応分（5 μg）のControl RNAが含まれます。
なお、Control RNAは、30個のアデニン塩基よりなるpolyA tailを持つ鎖長約1.4 kbのpolyA tailで、このRNAを鋳型に二本鎖cDNAを合成して、適当なプラスミドに挿入した際、二本鎖cDNAがfull-lengthのものであれば、プラスミドはテトラサイクリン耐性になります。
*6 インサートチェック及びシーケンスに使用可能です。配列情報は、こちら。T7 promoter primerは、BcaBEST Sequencing Primer T7（製品コード 3884）と同じ配列です。
注） 本製品には形質転換に必要な大腸菌は含まれません。メチル化DNAによる形質転換（エレクトロポレーション法）が可能な大腸菌、E. coli HST08 Electro-Cells（製品コード 9028）、 ClontechのSupercharge EZ10 Electrocompetent Cells（製品コード 636756）などを別途ご用意ください。
保存
17. Dr. GenTLE Precipitation Carrier、18. 3M Sodium Acetate (pH5.2)、Spin Column：4℃
その他のコンポーネント：－20℃
その他のコンポーネント：－20℃
システムの原理
キット以外に必要な試薬、器具類（主なもの）
- ＜試薬＞
- フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール (25:24:1, v/v/v)
- クロロホルム／イソアミルアルコール (24:1, v/v)
- エタノール
- TE バッファー(10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA, pH8.0)
- DNA サイズマーカー
- 1％ アガロースゲル (0.1 μg/ml エチジウムブロミド含有)
- エレクトロポレーション用コンピテントセル；E. coli HST08 Premium Electro-Cells（製品コード 9028）、Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells (製品コード 636756)など
- LB 培地
- LB/Amp (100 μg/ml) プレート
- ＜器具＞
- 微量遠心機（マイクロ遠心機）
- 恒温水槽（次の各温度設定で使用；温度によっては、サーマルサイクラーも可）；8℃、12℃、16℃、37℃、42℃、65℃、70℃
- マイクロピペット
- マイクロ遠心チューブ
- ピペットチップ
- FALCON チューブ（BD 社 Code No. 352059）
- エレクトロポレーション装置・器具類一式
- 電気泳動装置一式
- 注意事項
- 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
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