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sgRNAライブラリー発現レンチウイルスを、マニュアルに従って作製した。 レンチウイルスを48時間後に回収し、様々なMOIでCas9発現A375細胞に導入した。 48時間後に蛍光顕微鏡およびFACSにより導入効率を測定した。
Cas9発現A375細胞にsgRNAライブラリーを導入後、ハイグロマイシンにより選択し、増殖後、Cas9/sgRNA発現細胞を2つの集団に分けた。
Cas9+/sgRNA+細胞集団の一方に6-TGを添加してスクリーニングを行った。もう一方の細胞集団はコントロール(非スクリーニング細胞)として6-TGを添加せず培養した。両方の細胞集団を培養した後、Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kitを使用して、ゲノムDNAの精製とライブラリー調製を行い、イルミナ社MiSeqを使用して解析した。
Panel A. 6-TGでスクリーニングを行った細胞と行っていない細胞に対して、sgRNAの発現比較を行った。スクリーニングを行った細胞(青い点)では、6-TGの代謝に関わっているHPRT遺伝子をターゲットとしたsgRNA由来のリード数の優位な増加が見られ(赤い点)、今回の表現型の変化に関わっている候補遺伝子として示された。一方、非スクリーニング細胞(オレンジの点)では、各sgRNA由来のリード数はほぼ均一であった。
Panel B. スクリーニングを行った細胞について、HPRT遺伝子をターゲットとする4つのsgRNA由来のリード数が優位に増加していることが観察された(赤い点)。非スクリーニング細胞では、各sgRNA由来のリード数に大きな差はなかった(青い点)。
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