in vitro Transcription T7 Kit (for siRNA Synthesis)

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製品コード TaKaRa
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資料
TKR 6140 6140 in vitro Transcription T7 Kit (for siRNA Synthesis)
50回用 ¥37,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

本製品は、T7 RNA Polymeraseを用いたin vitro transcription反応により、大量の一本鎖RNAを合成するためのキットである。T7 RNA Polymeraseは、T7プロモーター配列を含む二本鎖DNAを鋳型としてプロモーター下流の配列を転写し、効率よく一本鎖RNAを合成する。例えば、20 ngのControl Template(直鎖状プラスミドDNA)を鋳型として約2 kbのRNAを合成する場合、20 μlの反応系で通常10 μg程度のRNAが得られる。T7プロモーター配列を持つプラスミドを直鎖状にして鋳型として利用できるほか、T7プロモーター配列を付加したPCR産物や合成DNAも鋳型として用いることができる。
また、本製品にはRNase T1が含まれており、in vitro transcription反応によりsiRNAの作製を行うこともできる。本キットを用いてsiRNAを作製するには、まず、T7プロモーター配列を付加したsiRNA配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド(センス鎖用とアンチセンス鎖用の2組)を用いてin vitro transcription反応を行い、一本の反応チューブ中でセンス、アンチセンスのそれぞれのRNAを同時に合成する。反応終了時にセンス鎖とアンチセンス鎖は反応液中でアニーリングしている。次に、RNase free DNase Iによる鋳型の除去およびRNase T1による処理を行った後、siRNAを精製し、RNAi実験に使用する。

内容

(20 μl反応、50回分)
10×Transcription Buffer100 μl
T7 RNA Polymerase50 U/μl100 μl
RNase Inhibitor40 U/μl25 μl
ATP Solution50 mM100 μl
GTP Solution50 mM100 μl
CTP Solution 50 mM100 μl
UTP Solution50 mM100 μl
RNase free DNase I5 U/μl200 μl
Control Template50 ng/μl20 μl
RNase T1100 U/μl25 μl
RNase T1 Dilution Buffer700 μl
RNase Free dH2O1 ml
10×Annealing Buffer*500 μl


* siRNA作製のための2本のオリゴヌクレオチドをアニーリングする際に使用する。
(組成;100 mM Tris-HCl (pH8.0)、500 mM CH3COOK、10 mM EDTA)

保存

-20℃

siRNA作製の概要

1) T7プロモーター配列を付加したsiRNA配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを2組作製する。

2) 作製した2組の二本鎖オリゴヌクレオチドを鋳型として一本のチューブ内でin vitro transcription反応を行い、センス、アンチセンスそれぞれのRNAを同時に合成する。合成されたRNAは二本鎖を形成する。

3) DNase Iによる鋳型オリゴヌクレオチドの除去およびRNase T1による一本鎖RNA部分(GGG)の分解を行う。

4) 3'末端2塩基が突出したsiRNAを精製、回収する。

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