AAVpro® Helper Free System

アデノ随伴ウイルス上のドナーDNAを用いた高効率ノックイン―ゲノム編集

【実験の流れ】

実験の流れ

【方法】 ドナー AAVベクターの調製

試薬等の準備
ドナ―AAVベクタープラスミドのマップ

ドナーAAVベクタープラスミドのマップ
（クリックで拡大します）
pAAV-CMV Vectorへの目的遺伝子のクローニングとベクタープラスミドの調製
AAVpro Helper Free System(AAV6)のpAAV-CMV VectorをCla I処理することで、プロモーター領域からPoly A配列を除去し、ITRとITRの間に、相同組換えに必要なフラグメント（L・R-arm）とAcGFPを含むフラグメントを挿入した。クローニングにはDNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞を用いた。その後、目的遺伝子を含むプラスミドを調製した。
HEK293T細胞へのトランスフェクション
調製したベクタープラスミドとAAVpro Helper Free System(AAV6)中のpRC6 VectorおよびpHelper Vectorのプロトコールに従い、TransIT-293 Transfection Reagentを用いてトランスフェクションした。
AAVベクターの回収
トランスフェクションの翌日に培地を2％FBS含有DMEMに交換した。トランスフェクションから2日後に0.5 M EDTA(pH8.0)を終濃度6.25 mMとなるように培地に加えて細胞を剥離し、AAV Extraction Solutionを使用してベクターを抽出した。
ウイルス力価の測定
AAVpro Titration Kit (for Real Time PCR) Ver.2を用いて、AAVベクターの力価測定を実施した。

【方法】 ゲノム編集・感染

試薬等の準備
Cas9タンパク質：Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl)（製品コード 632641など）
sgRNA：Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit（製品コード 632635）によりGAPDH遺伝子に対するsgRNAを調製
ドナーAAVベクター：調製したドナーAAVベクター
Cas9 Plasmid：Cas9発現プラスミド
sgRNA Plasmid：sgRNA発現プラスミド
ドナーPlasmid：L・R-armとAcGFP発現プラスミド
遺伝子導入機器：Neon Transfection System（Thermo Fisher Scientific社）
ドナーAAVベクタープラスミドのマップ

ドナーPlasmidのマップ
（クリックで拡大します）
1日目：ゲノム編集・感染
実験1．Cas9 PlasmidとsgRNA PlasmidとドナーPlasmidを使用
  1. ドナーPlasmid とsgRNA Plasmid、Cas9 Plasmidを混合する。
  2. HEK293T細胞を1×105 cells/10 μlになるように、1）の溶液で懸濁する。
  3. Neon Transfection Systemを用いてエレクトロポレーションを実施する。
  4. プレートに播種して、培地で培養する。
実験2．RNPとドナーPlasmidを使用
  1. Cas9タンパク質とsgRNAを加えピペッティングしてRNP溶液を調製する。
  2. RNP溶液を37℃で5分間インキュベート
  3. ドナーPlasmidを混合する。
  4. HEK293T細胞を1×105 cells/10 μlになるように、3）の溶液で懸濁する。
  5. Neon Transfection Systemを用いてエレクトロポレーションを実施する。
  6. プレートに播種して、培地で培養する。
実験3．RNPとドナーAAVベクターを使用
  1. Cas9タンパク質とsgRNAを加えピペッティングしてRNP溶液を調製する。
  2. RNP溶液を37℃で5分間インキュベート
  3. HEK293T細胞を1×105 cells/10 μlになるように、2）の溶液で懸濁する。
  4. Neon Transfection Systemを用いてエレクトロポレーションを実施する。
  5. プレートに播種する。
  6. ドナーAAVベクターをMOI 900でプレートの細胞へ添加してAAVを感染させる。
  7. インキュベート

3～4日目：細胞の継代
細胞を剥離し継代
7日目：フローサイトメーターによるノックイン効率の測定
HEK293T細胞のAcGFP発現細胞の割合をFlow cytometryを用いて解析し、ノックイン効率を測定した。
NTは無処理の細胞を示す。

【結果】

結果

  AAVpro® Helper Free System