3'-Full RACE Core Set

本製品は3’-RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法によって、mRNAの3’末端を含む領域を特異的に増幅するためのCore Setである。Oligo dT-3sites Adaptor Primerは、効率良くcDNAを合成できるよう工夫している。また、3sites Adaptor PrimerにはBamH I、Kpn I、Xba Iの制限酵素部位があり、クローニングを容易に行うことができる。この際には上流の特異的プライマーの5’側にも以下の配列を付加しておくと便利である。

図1．3sites Adaptor Primerの配列および制限酵素サイト

（20回分）

1.	AMV Reverse Transcriptase XL （5 U/μl）	20 μl
2.	RNase Inhibitor （40 U/μl）	10 μl
3.	Oligo dT-3sites Adaptor Primer （2.5 μM）	20 μl
4.	RNase Free dH2O	500 μl
5.	3sites Adaptor Primer （20 μM）	20 μl
6.	10×RNA PCR Buffer*1	40 μl
7.	dNTP Mixture （各10 mM）	40 μl
8.	MgCl2 （25 mM）	80 μl
9.	Control F-1-3sites Adaptor Primer （20 μM）*2	10 μl
10.	Positive Control RNA （2×105 copies/μl）*3	10 μl

*1　100 mM Tris-HCl (pH8.3)、500 mM KCl
*2　Positive Control RNA用上流プライマー
*3　pSPTet3 プラスミドの転写 polyA⁺ RNA

－20℃

本製品に添付されているControl RNAは、SP6 Promoter領域下流にpBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を含む約1 kbの断片を挿入したプラスミドpSPTet3を鋳型として、SP6 RNA Polymerase を用いてin vitro transcriptionにより合成を行ったものである。
このControl RNAは、30個のアデニン塩基によるpolyA^＋ tailを持つ鎖長約1.4 kbのpolyA^＋ mRNAで、このRNAを鋳型に二本鎖cDNAを合成して、適当なプラスミドに挿入した際、この二本鎖cDNAが完全長のものであれば、このプラスミドはテトラサイクリン耐性になる。

図1 Positive Control RNA：各プライマーを用いた際の増幅断片

• 既知領域特異的上流プライマー
• TaKaRa Taq（製品コード R001A/B/C）もしくはTaKaRa Ex Taq（製品コード RR001A/B/C）もしくはTaKaRa LA Taq（製品コード RR002A/B）

(1) Oligo dT-3sites Adaptor Primerを用いて逆転写反応を行い、目的とするmRNA由来の1st strand cDNAを合成する。
(2) Xba I、Kpn I、BamHI Site 含有既知配列特異的上流プライマーと3sites Adaptor PrimerでPCRを行う。
(3) PCR産物を適当な制限酵素（Xba I、Kpn I または BamH I）で切断する。
(4) 適当なベクターにクローニングし、シーケンス解析を行う。