厚生労働省通知法に収載されたレジオネラ属菌の遺伝子検査法（生菌検出法、生菌死菌検出法）

令和元年9月19日に、厚生労働省医薬・生活衛生局生活衛生課長通知「公衆浴場における浴槽水等のレジオネラ属菌検査方法について」（薬生衛発0919第1号）が発出された。本検査方法は、厚生労働科学研究での研究成果を踏まえ、レジオネラ属菌の検査方法の平準化等を目的として策定された。
本通知では、迅速検査法も一つの項目として収載され、各種方法が紹介されている。リアルタイムPCR法などの一般的な遺伝子検査では、生菌のみならず死菌であってもDNAを検出するため、すべての陽性結果が感染の危険性を示すわけではない。そのため、迅速検査法を有効活用する場としては、「清掃・消毒管理された検水におけるレジオネラ属菌の陰性確認」および「培養法と併用したスクリーニング検査」が挙げられてきた。
これに対し、LC EMA-qPCR法は、液体培養により生菌を選択的に増殖させ、さらにEMA処理により死菌由来のPCR検出を抑制することで、遺伝子検査の最大の特長である迅速性に加え、生菌を選択的に検出する利点を備えている。

厚生労働省通知に収載されたレジオネラ属菌の遺伝子検査法について

分類	手法	用途	結果判定	検査法の特長	詳細
生菌 検出法	1 LC EMA- qPCR	◎（レジオネラ属菌の） 　水質基準適合判断※ ○スクリーニング検査	検査開始 2日目	液体培養（18時間）とEMA処理の組み合わせにより、生菌を選択的に検出できる	詳しくは こちら
生菌死菌 検出法	2 qPCR	◎陰性確認 ○スクリーニング検査	検査開始 1日目	ろ過濃縮検体からqPCR検出を行う。死菌の存在も潜在的な汚染リスクとして評価できる	詳しくは こちら

液体培養（LC）

18時間の液体培養により生菌のみが増殖し、液体培養前に比べ、相対的に生菌の存在比率が高くなることで、生菌の選択性が向上する。

EMA処理

死菌由来DNAをEMA（ethidium monoazide）修飾することでPCR増幅を抑制し、生菌由来DNAの選択的な検出を可能にする。

EMA-PCR法の原理について、詳しくはこちらもご覧ください。

DNA抽出

簡易抽出試薬またはカラム精製により、リアルタイムPCR用の鋳型DNAを調製する。

リアルタイムPCR

リアルタイムPCRによりレジオネラ属菌の遺伝子検出を行う。
キットに添付のポジティブコントロールを用いた定量解析が可能である。

※ 「第4版レジオネラ症防止指針」に収載されている「EMA-qPCR法」については、こちらのページをご参照ください。