Viable Bacteria Selectionシステムによる生菌由来DNAの選択的検出（EMA-PCR法）

現在、微生物の検出および同定には主として培養法が用いられているが、食品・環境分野などにおいても、より簡便かつ迅速な方法として遺伝子検出法が普及しつつある。しかし、遺伝子検出法には死菌由来DNAも検出するという課題があり、これを解決するため、PCRやリアルタイムPCR（qPCR）を利用した生菌選択的な検出法としてEMA-PCR法が開発された。EMA-PCR法とは、選択的膜透過性色素（EMA：ethidium monoazide）が死菌由来DNAを修飾し、修飾を受けたDNAがPCR増幅できない状態となることを利用して、生菌由来DNAを選択的に検出する方法である。タカラバイオのViable Bacteria SelectionシステムはこのEMA-PCR法を応用しており、さらに独自の技術で死菌由来DNAのEMA修飾効果を向上させたことで、増幅サイズが短いリアルタイムPCRでも効果的な生菌由来DNAの選択的検出が可能となっている。

EMAは可視光に暴露すると、核酸に共有結合する色素である。生菌を含む検体にEMAを含む試薬を添加して光を照射しても生菌では薬剤が内部に浸透せずDNAへの化学修飾は起こらない。一方、死菌由来DNAやその他、検体に含まれるDNAはEMAによって化学修飾される。EMAにより修飾されたDNAは、PCR反応の鋳型とならず遺伝子増幅できないため、EMA処理後のPCR法による検出では生菌由来DNAのみが検出される。


図1. EMA-PCR法の原理

図2. Viable Bacteria Selectionシステムのフロー

ステップ1（EMA処理；EMAの浸透）： 選択的膜透過性色素（EMA）を含む試薬を検体に添加し、氷上で遮光静置する。
ステップ2（EMA処理；光照射）： 光照射によりEMAと核酸を結合させる。
ステップ3（DNA抽出）： EMA処理後のサンプルよりDNAを抽出する。
ステップ4（PCR／qPCR検出）： ターゲット細菌の遺伝子検出を行う。

●独自技術による高効率化
Viable Bacteria Selectionシステムでは、EMA処理に独自の技術を施し、EMA修飾の効率化を実現したことにより、非常に効率よく死菌由来DNAを修飾できる。死菌由来DNAへの修飾効果が向上したことで、リアルタイムPCRのように増幅サイズが短い場合にも効果的に死菌由来DNAの増幅を排除できるようになった。本技術は高感度なリアルタイムPCRへの適用が可能である。

●EMA処理成否チェックのための工夫
Viable Bacteria Selectionシステムでは、EMA処理が正常に行われたかどうかを確認するための工夫が施されている。EMA処理用の試薬コンポーネントには、反応確認用のプラスミドDNAがあらかじめ添加されており、検体に対してEMA処理が正しく行われるとこのプラスミドDNAも同時に修飾を受け、PCR増幅できなくなる。従って、プラスミドDNA上の領域をターゲットとしてPCR増幅を行うことで、EMA処理操作が阻害を受けずに行われたかどうかを確認できる［Control Test Kit (Viable Bacteria Selection)を使用］。実検体の反応では、検体中に含まれる様々な夾雑物による影響が懸念されるが、事前にEMA処理の成否を確認できるため、無駄のない精度の高い検討が可能である。

PCR／qPCRによる生菌由来DNA検出		EMA処理成否確認のための確認反応
生菌由来DNA検出の評価

●専用装置で精度の高い検討が可能
Viable Bacteria Selectionシステムでは、EMA処理時の光照射に使用できる専用装置LED Closslinker 30（製品コード EM300）も用意している。EMA処理の条件設定では、光の照射時間および照射距離を検証する必要があり、市販のLEDランプやハロゲンランプの使用も可能であるが、専用装置を活用すれば精度の高い安定したデータ取得に有効である。本装置は高輝度LEDランプ搭載のため長期使用が可能である。

Viable Bacteria Selectionシステムは、検出目的の細菌をターゲットとした既存のPCRあるいはリアルタイムPCR系への応用が可能である。大腸菌などのグラム陰性菌に対するEMA処理試薬 Viable Bacteria Selection Kit for PCR（Gram Negative）（製品コード 7700）、あるいはBacillus属、Listeria属、Staphylococcus属、Bifidobacterium属などのグラム陽性菌に対するEMA処理試薬Viable Bacteria Selection Kit for PCR（Gram Positive）（製品コード 7705）を用いてEMA処理条件を最適化し、お手持ちのPCR／qPCR検出系と組み合わせることで、目的細菌の生菌由来DNA選択的検出系を構築することができる。

ステップ		関連製品
		グラム陰性菌	グラム陽性菌
1	EMA処理；EMAの浸透	Viable Bacteria Selection Kit for PCR（Gram Negative）（製品コード 7700）	Viable Bacteria Selection Kit for PCR（Gram Positive）（製品コード 7705）
2	EMA処理；光照射	LED Crosslinker 12（製品コード EM200：終売） LED Crosslinker 30（製品コード EM300）
3	DNA抽出	NucleoSpin Tissue XS（製品コード 740901.10/.50/.250） など
4-1	PCR／qPCR検出	お手持ちの検出試薬
4-2	EMA処理成否のチェック	Control Test Kit（Viable Bacteria Selection）（製品コード CY290）

概要や操作方法などについて詳しく記載しています。

Viable Bacteria Selectionシステムでは、レジオネラ属菌、腸管出血性大腸菌およびカンピロバクターなど各ターゲット細菌用に至適化した試薬キットも用意している。至適化済みの条件でEMA処理を行い、CycleavePCRキット（サイクリングプローブ法を利用したリアルタイムPCRキット）と組み合わせて検出を行う。
★レジオネラ属菌用には、「EMA-PCR法」に「液体培養（Liquid Culture）」を組み合わせることで、より確実な生菌選択性を実現する「LC EMA-qPCR法」用キットもあります。
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