PCR1で付加されたアダプターは、イルミナ社次世代シーケンサーのフローセルへの結合部位(P7、P5)およびIndex(Index 1 [i5]、Index 2 [i7])配列を含んでおり、シーケンスプライマーRead 2およびRead 1を認識する領域も含んでいる。
Read 1は元のRNAのアンチセンスの配列が得られ、Read 2では元のRNAのセンス鎖の配列が得られる。Read 2を用いた場合の最初の3塩基 (XXX)はSMART-Seq Stranded Adapter由来の配列になるので、paired-end sequencingを行った場合、この3塩基はマッピング前にトリミングする必要がある。
Sequencing alignment metrics for 10 pg–10 ng total RNA | |||||
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RNA source | Human brain total RNA | ||||
Input amount (ng) | 10 | 1 | 0.25 | 0.05 | 0.01 |
Number of reads (paired-end) | 2,500,000 | 2,500,000 | 2,500,000 | 2,500,000 | 1,000,000 |
Number of transcripts > 1 FPKM | 15,128 | 15,097 | 15,066 | 14,394 | 13,151 |
Number of transcripts > 0.1 FPKM | 23,864 | 23,631 | 23,274 | 21,335 | 16,700 |
Pearson/Spearman correlations | 0.99/0.87 | 0.99/0.85 | 0.99/0.82 | 0.97/0.68 | 0.92/0.46 |
Correct strand per biological annotation (%) | 97.7 | 97.8 | 97.6 | 97.5 | 97.1 |
Proportion of reads (%): | |||||
Exonic | 37.1 | 36.5 | 41.5 | 39.7 | 34.1 |
Intronic | 36.1 | 35.6 | 36.7 | 35.4 | 30.6 |
Intergenic | 8.6 | 8.5 | 8.8 | 8.7 | 7.4 |
rRNA | 9.7 | 9.6 | 3.6 | 4.1 | 6.7 |
Mitochondrial | 5.2 | 6.3 | 6.4 | 6.4 | 5.9 |
Overall mapping (%) | 96.8 | 96.4 | 97 | 94.4 | 84.7 |
Duplicate rate (%) | 13.3 | 20.2 | 35.2 | 59.0 | 62.4 |
ヒト脳の total RNA(10 pg~10 ng)から本キットと用いて、RNA-seqライブラリーを作製し、NextSeq 500でシーケンスを行った。
本表のデータは、三連の実験の平均を示し、わずか10 pgのRNA input量の場合でも非常に高い再現性(Pearson/Spearman)を示した。
Panel A:ヒト脳のtotal RNA(50 pg~10 ng)を用いてSMART-Seq Stranded KitおよびSMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian(Pico v2)を用いてRNA-seqライブラリーを三連で作製した。取得したデータは250万リード(paired-end)で解析を行った。
Pico v2 KitのインプットRNAの範囲(250 pg~10 ng)では、両キットでほぼ同等の性能を示したが、1 ng以下では、SMART-Seq Stranded Kitのほうがより多くのトランスクリプトを検出した。
Panel B:50 pgの total RNAから各々のキットで作製されたライブラリーを用いて発現解析を行い、再現性を比較した。
SMART-Seq Stranded Kit(Pearson=0.97)は50 pg total RNAにおいてもPico v2(Pearson=0.92)よりも高い再現性を示した。
Sequencing alignment metrics for A375 total RNA and cells | |||||||
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Input | Total RNA | 1,000 cells | 500 cells | 100 cells | 10 cells | 5 cells | 1 cell |
Number of reads (pairs) | 6,000,000 | 6,000,000 | 6,000,000 | 6,000,000 | 6,000,000 | 6,000,000 | 5,873,974 |
Number of transcripts >1 FPKM |
13,260 | 13,294 | 13,583 | 13,520 | 12,726 | 12,602 | 11,540 |
Number of transcripts >0.1 FPKM |
21,334 | 21,113 | 21,365 | 21,145 | 20,550 | 18,888 | 15,815 |
Proportion of reads(%): | |||||||
Exonic | 34.7 | 36.4 | 39.2 | 42.7 | 36.7 | 36.2 | 37.3 |
Intronic | 29.6 | 29.3 | 27.7 | 28.3 | 34 | 30.4 | 21.1 |
Intergenic | 14.2 | 13.4 | 12.2 | 12.9 | 16.7 | 16.8 | 10.1 |
rRNA | 7.0 | 11.4 | 11.5 | 6.3 | 3.6 | 4.9 | 7.1 |
Mitochondrial | 4.1 | 3.5 | 3.7 | 4.9 | 3.8 | 4.4 | 4.6 |
Overall maping (%) | 89.6 | 93.9 | 94.3 | 95.1 | 94.9 | 92.7 | 80.2 |
Duplicate rate(%) | 37.3 | 45.2 | 40.3 | 46.1 | 52.5 | 72.2 | 78.5 |
lncRNA mapping: | |||||||
Number of mapped reads(%) | 7.2 | 10.4 | 10.8 | 9.4 | 8.7 | 8.6 | 7.3 |
lncRNA transcripts detected | 5,395 | 4,687 | 4,565 | 5,439 | 5,440 | 4,983 | 2,802 |
セルソーティングによって単離されたA375細胞から、SMART-Seq Stranded Kitを用いてライブラリーを作製した。インプットした細胞数は1細胞から1,000細胞で、5~1,000細胞は二連、1細胞は12連で行った。 比較のために1,000細胞から精製したtotal RNAを用いて二連でライブラリーを作製した。
Panel A: 1~1,000細胞から調製したライブラリーの評価
Panel B: Panel Aに示された全てのサンプル間のユークリッド距離を表示した階層的クラスタリング解析。Pearson相関係数は0.85から0.99を示した。シングルセルはCell1~Cell12と表示し、他のインプット量の細胞のレプリケートはa~bと表示している。
【ユーザー様実施例】レーザーマイクロダイセクションで採取した細胞由来の微量分解RNAのリアルタイムPCRによる遺伝子発現解析
セルソーターを用いたシングルセルRNA-Seq実験を成功させるための5つのTips
シングルセルRNA-seq実験を成功させるための5つのTips
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RNA-seqを成功させるためのコツ(英語)
SMART-Seq® Stranded Kitによる卵巣がんの解析(英語)
RNA-seqのヒント(英語)
コントロールサンプルの準備(英語)
Total RNA-seqの概要(英語)
がんアプリケーションにおけるシングルセル解析(英語)
低価格・簡便操作の全長mRNA解析(シングルセル or 超微量)
Illumina社NGSプラットフォームおよびIon TorrentのためのcDNA調製キット(超微量)
方向性の情報をもつNGS用ライブラリー作製が可能 (total RNA量 10~100 ng)
イルミナ社NGS装置用の超微量mRNA-Seq用ライブラリー調製キット
次世代シーケンサーを用いたWhole Transcriptome解析
シングルセルまたはtotal RNA 10 pgからの方向性情報を持ったtotal RNA-Seq解析