SMART-Seq^® HT Kit

SMART-Seq HT(右)は、SMART-Seq v4のプロトコール（左）を改変することにより、簡便でハイスループットなワークフローで行える。セルソーターによりシングルセルを取得した後、SMART-Seq v4 Kitの場合、6つのハンズオンステップが含まれるが、SMART-Seq HT Kitの場合は、3つのハンズオンステップのみで行える。SMART-Seq HTワークフローの重要なステップは、効率的な逆転写およびPCR cDNA増幅のために最適化されたOne-Step RT-PCR Bufferを使用してOne-Step RT-PCRを行うことである。 One-Step RT-PCR BufferはLysis Bufferを添加する必要がなく、AMPureビーズ精製が可能である。SMART-Seq HT Kitは、従来のSMART-Seq v4 Kitと同様に、シーケンス用のライブラリー調製（Nextera XT）の前に、調製したcDNAの検証（定量、サイズ分布）が必要である。

SMART-Seq v4 Kit（SSv4_1～SSv4_12）およびSMART-Seq HT Kit (HT_1 to HT_9)を用いて、293T細胞の21個のシングルセルからライブラリーを作製し、各細胞について得られた遺伝子発現の再現性を評価した。
階層的クラスタリングヒートマップは、細胞間のユークリッド距離を示し、0.74から0.97の範囲のピアソン相関を示した。最良の相関関係は同一キットで調製された細胞間で観察されるが、2つのキット間の相関関係も非常に高く、キットの違いによるクラスター化はしていない。これらのデータより、簡便ワークフローを採用したSMART-Seq HTはSMART-Seq v4と比較して、遺伝子発現解析において大きな偏りがないことを示した。

マウス脳のtotal RNA 10 pgから作製したライブラリーを、GC含有量（≦36％、37～54％、≧55％）についてさらに分析した（パネルA）。遺伝子をGC含量で分類し、スキャッタープロットを使用して各分類内の遺伝子の発現レベル（FPKM）の再現性を視覚化した。遺伝子発現レベルはSMART-Seq v4（パネルB）またはSMART-Seq HT Kit（パネルC）を用いた場合でも、replicate間において非常に高い再現性を示した。高または低GC含量の遺伝子（それぞれ赤色および青色で示す）は、SMART-Seq v4 KitとSMART-Seq HT Kit（パネルD）間においても同様の発現レベルを示した。このように、SMART-Seq HT Kitで採用されているOne step RT PCR反応は低および高GC含量遺伝子の発現に影響を与えなかった。

マウス脳 total RNA10 pgから調製したライブラリーを、各キット内のreplicate間で検出されたトランスクリプト（FPKM＞0.1）のオーバーラップ数について評価した結果、各キットにおいて非常に類似していた（SMART-Seq v4：61％、SMART-Seq HT：63％）（パネルB）。また、各キットの3つのreplicateすべてによって同定されたトランスクリプトを互いに比較した結果、71％のオーバーラップ率を示した。オーバーラップしているトランスクリプトの発現量は平均37 FPKMだが、一方のキットでのみ同定されたトランスクリプトは少なく、発現量が平均6～7 FPKMであった。

Panel A　SMART-Seq HT PLUS Kit（終売）を使用して10 pgのマウス脳total RNAから3連でcDNAを作成した。次に、SMART-Seq HT PLUS Kit（終売）に含まれるSMART-Seq Library Prep KitまたはNextera XT Kit（イルミナ社）を使用して、Illumina社シーケンサー用のライブラリーを調製した。ライブラリーを4M paired-endリードにノーマライズし、NextSeq500でシーケンスを行った。
Panel B　SMART-Seq HT PLUS Kit（終売）はNextera XTより高収量のライブラリーが得られた。
Panel C　SMART-Seq HT PLUS Kit（終売）は、Nextera XTと比較してより多くの遺伝子が同定できた。