レンチウイルスqRT-PCR迅速タイター測定キット

Lenti-X qRT-PCR Titration Kitを用いると、組換えレンチウイルスの力価（RNAタイター）を極めて迅速、簡便かつ正確に測定できる。RNAの簡易精製を行った後、One-Step qRT-PCRとインターカレーター法を組み合わせて、添付の校正用RNAを用いて作成した検量線からウイルスゲノム量を測定する（図1）。


図1. Lenti-X qRT-PCR Titration Kitの操作手順

短時間のRNAタイター測定により再現性の高い感染実験が可能

感染性を基にした標準的な力価測定法には、蛍光マーカー、薬剤耐性、または細胞染色を用いた方法があるが、終了までに2～10日間を要する。（図2）。これらの中で、最も迅速なフローサイトメトリーによる測定でさえ、48時間未満では力価を正確に得ることができない。
このような長時間を要する力価測定法では、凍結解凍の繰り返しや長期のウイルス保管を余儀なくされ、その間にウイルスストックの感染性が低下してしまう。しかし、その低下の程度は測定できない。多くの場合、何日も経った推定力価をやむなく感染性とMOIの算出に使用することになる。


図2. Lenti-X qRT-PCR Titration Kitは非常に短時間で力価測定可能
標準的な形質導入による力価測定法は、終了までに最長10日間を要する。一方、Lenti-X qRT-PCR Titration Kitの所要時間はわずか4時間で、ウイルスの回収、力価測定、および標的細胞への感染全てを同日中に実施できる。

一方、ClontechのqRT-PCRタイター測定法ではわずか4時間で結果が得られる。qRT-PCR法を用いることでタイター測定に要する時間、すなわちウイルス回収後、感染を行うまでのインターバルを短縮でき、ウイルス回収を行ったその日のうちに感染までを行うことが可能になる。力価測定に時間を要してウイルス力価の低下を招くことがなくなるため、意図した通りのMOIで感染を行い再現性の高い結果を得ることができる。

Lenti-Xタイター測定キットには、ウイルスサンプルまたはキットに同梱のコントロールRNAを用いるqRT-PCR反応200回分の試薬が含まれている。本キットはすべてのHIV-1ベースのレンチウイルスベクターに使用できる。発現カセット（cDNA、shRNA）やウイルスバックボーンに左右されることなく、正確な力価が得られるため、複数のウイルス試料の同時測定が可能である。RNA精製ステップおよびDNase I処理ステップがあるため、一過性トランスフェクションで産生したウイルス中にプラスミドDNAが残留していても、安定産生株から産生したウイルスと同様、少量のサンプルで正確な力価測定が行える（3）。


図3. Lenti-X qRT-PCR力価測定法は広い測定領域をカバー
パネルA：Lenti-X qRT-PCR Titration Kitを用いたリアルタイムRT-PCRで、2×10⁹～10²コピーのLenti-X RNA Control Templateを検出した際の増幅曲線。テンプレート無し（No-Template-Control：NTC）のバックグラウンドが低く、測定領域が6桁以上に及ぶことがわかる。
パネルB：パネルAの増幅曲線から得られた検量線。広い範囲のRNAコピー数に対し、高い直線性を示す。（R2：1.00、PCR効率＝99.3％）


図4. Lenti-X qRT-PCR Titration Kitを用いたウイルス上清の力価測定
精製したレンチウイルスゲノムの10倍段階希釈液を用いた力価測定結果の例。レンチウイルスをクロンテックのLenti-X HTX Packaging Systemを用いて一過性トランスフェクションにより産生した。3日後、レンチウイルス上清を回収し、qRT-PCRによる力価測定まで－80℃で保管した。

操作が簡便で再現性がよく、短時間で正確な結果が得られるqRT-PCR Titration Kitは、RNAタイターの測定に最適である。ウイルスストックの生物学的タイター（IFU/ml）を独立した他の方法で決定し、RNAタイター（copies/ml）との相関値（copies/IFU）をあらかじめ求めておけば、短時間で得られるRNAタイターから生物学的タイターを推定して、MOIを決定することも可能である。

Lenti-X qRT-PCR Titration Kit
（製品コード 631235）
・Lenti-X RNA Control Template
・Forward and Reverse Titer Primers
・DNase I
・DNase I Buffer (10×)
・EASY Dilution Buffer for RT-PCR
・Quant-X One-Step qRT-PCR TB Green Kit (200回用) ・NucleoSpin RNA Virus Kit (10回用)

＊ウェル間の蛍光シグナルの補正を行う装置で解析する場合に使用します。

• ROX Reference Dye LSRを添加する機種
  光源がレーザーの機種 　：Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System　（Thermo Fisher Scientific） など
  （注意）StepOne/ StepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）はLED光源ですが、ROX Reference Dye LSRをご使用ください。
• ROX Reference Dye LMPを添加する機種
  光源がLamp またはLEDの機種　：Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific） など

Lenti-X RNA Control Template：－70℃
NucleoSpin RNA Virus Kit：室温
その他のコンポーネント：－20℃