低価格・簡便操作の全長mRNA解析（シングルセル or 超微量）
- 高感度 - わずか1細胞または10 pg total RNAからcDNA調製が可能（使用範囲：1～100細胞または10 pg～1 ng total RNA）
- 高品質のRNA-Seqデータ - 完全長の遺伝子情報を保持し、rRNAのリード割合が低く、GC richのトランスクリプトも効率よく増幅
- 簡便なワークフロー - One step RT-PCR反応でcDNAを作製
- 簡単なサンプル調製 - シングルチューブによるプロトコールで細胞全体を反応に用いるため、ロスがなく調製可能
- cDNA合成に加え、イルミナ社NGS装置用のライブラリー調製キットとIndexを含む“完璧”なPLUS Kitもラインナップ ⇒詳細はこちら
cDNA合成、ライブラリー調製、
Indexを含むPLUS Kit
SMART-Seq HT Kit
製品説明
SMART-Seq HT Kitは、10 pg～1 ng total RNAまたは1～100細胞からOligo(dT)プライミング法を用いて高品質な全長cDNAを調製することができる。本キットは逆転写およびPCR増幅をワンステップで行うため、SMART-Seq v4に比べると、ハンズオンタイムの少ない簡便なプロトコールとなっている。本キットは簡便なプロトコールに変わっているが、SMART-Seq v4と同等の感度と再現性を持つ。
本キットで用いるSMART技術は、スプライスジャンクションや細胞内の選択的スプライシングを含む遺伝子発現研究における非常に強力なツールであり、完全長の遺伝子を検出できる。Oligo（dT）によるプライミングで、高品質total RNA（RIN＞8）またはインタクトな細胞からmRNAを特異的に増幅する。また、SMART-Seq v4と同様にLNA技術を取り入れることにより、テンプレートスイッチング効率を向上させ、他の方法よりも検出される遺伝子数は増加している。
SMART-Seq HT PLUS Kitは、10 pg～1 ng total RNAまたは1～100細胞からRNA-Seqに適した高品質のイルミナ社シーケンサー用のライブラリーを調製するために設計された完全なキットである。SMART-Seq HT PLUS Kitには、SMART-Seq HT Kitと、完全長cDNAの断片化を行うためのSMART-Seq Library Prep Kitおよびインデックスを付加するためのUnique Dual Index Kitが含まれている。Unique Dual indexを使用することにより最大96サンプルのマルチプレックス解析が可能になる。
ライブラリー調製およびインデックス試薬を含むランダムプライミングを行う場合は、SMART-Seq Stranded Kitを推奨する。
本キットで用いるSMART技術は、スプライスジャンクションや細胞内の選択的スプライシングを含む遺伝子発現研究における非常に強力なツールであり、完全長の遺伝子を検出できる。Oligo（dT）によるプライミングで、高品質total RNA（RIN＞8）またはインタクトな細胞からmRNAを特異的に増幅する。また、SMART-Seq v4と同様にLNA技術を取り入れることにより、テンプレートスイッチング効率を向上させ、他の方法よりも検出される遺伝子数は増加している。
SMART-Seq HT PLUS Kitは、10 pg～1 ng total RNAまたは1～100細胞からRNA-Seqに適した高品質のイルミナ社シーケンサー用のライブラリーを調製するために設計された完全なキットである。SMART-Seq HT PLUS Kitには、SMART-Seq HT Kitと、完全長cDNAの断片化を行うためのSMART-Seq Library Prep Kitおよびインデックスを付加するためのUnique Dual Index Kitが含まれている。Unique Dual indexを使用することにより最大96サンプルのマルチプレックス解析が可能になる。
ライブラリー調製およびインデックス試薬を含むランダムプライミングを行う場合は、SMART-Seq Stranded Kitを推奨する。
SMART-Seq HT(右)は、SMART-Seq v4のプロトコール（左）を改変することにより、簡便でハイスループットなワークフローで行える。セルソーターによりシングルセルを取得した後、SMART-Seq v4 Kitの場合、6つのハンズオンステップが含まれるが、SMART-Seq HT Kitの場合は、3つのハンズオンステップのみで行える。SMART-Seq HTワークフローの重要なステップは、効率的な逆転写およびPCR cDNA増幅のために最適化されたOne-Step RT-PCR Bufferを使用してOne-Step RT-PCRを行うことである。 One-Step RT-PCR BufferはLysis Bufferを添加する必要がなく、AMPureビーズ精製が可能である。SMART-Seq HT Kitは、従来のSMART-Seq v4 Kitと同様に、シーケンス用のライブラリー調製（Nextera XT）の前に、調製したcDNAの検証（定量、サイズ分布）が必要である。
SMART-Seq v4 Kit（SSv4_1～SSv4_12）およびSMART-Seq HT Kit (HT_1 to HT_9)を用いて、293T細胞の21個のシングルセルからライブラリーを作製し、各細胞について得られた遺伝子発現の再現性を評価した。
階層的クラスタリングヒートマップは、細胞間のユークリッド距離を示し、0.74から0.97の範囲のピアソン相関を示した。最良の相関関係は同一キットで調製された細胞間で観察されるが、2つのキット間の相関関係も非常に高く、キットの違いによるクラスター化はしていない。これらのデータより、簡便ワークフローを採用したSMART-Seq HTはSMART-Seq v4と比較して、遺伝子発現解析において大きな偏りがないことを示した。
マウス脳のtotal RNA 10 pgから作製したライブラリーを、GC含有量（≦36％、37～54％、≧55％）についてさらに分析した（パネルA）。遺伝子をGC含量で分類し、スキャッタープロットを使用して各分類内の遺伝子の発現レベル（FPKM）の再現性を視覚化した。遺伝子発現レベルはSMART-Seq v4（パネルB）またはSMART-Seq HT Kit（パネルC）を用いた場合でも、replicate間において非常に高い再現性を示した。高または低GC含量の遺伝子（それぞれ赤色および青色で示す）は、SMART-Seq v4 KitとSMART-Seq HT Kit（パネルD）間においても同様の発現レベルを示した。このように、SMART-Seq HT Kitで採用されているOne step RT PCR反応は低および高GC含量遺伝子の発現に影響を与えなかった。
マウス脳 total RNA10 pgから調製したライブラリーを、各キット内のreplicate間で検出されたトランスクリプト（FPKM＞0.1）のオーバーラップ数について評価した結果、各キットにおいて非常に類似していた（SMART-Seq v4：61％、SMART-Seq HT：63％）（パネルB）。また、各キットの3つのreplicateすべてによって同定されたトランスクリプトを互いに比較した結果、71％のオーバーラップ率を示した。オーバーラップしているトランスクリプトの発現量は平均37 FPKMだが、一方のキットでのみ同定されたトランスクリプトは少なく、発現量が平均6～7 FPKMであった。
Panel A SMART-Seq HT Kitを使用して10 pgのマウス脳total RNAから3連でcDNAを作成した。次に、SMART-Seq Single Cell PLUS Kitに含まれるSMART-Seq Library Prep KitまたはNextera XT Kit（イルミナ社）を使用して、Illumina社シーケンサー用のライブラリーを調製した。ライブラリーを4M paired-endリードにノーマライズし、NextSeq500でシーケンスを行った。
Panel B SMART-Seq HT PLUS KitはNextera XTより高収量のライブラリーが得られた。
Panel C SMART-Seq HT PLUS Kitは、Nextera XTと比較してより多くの遺伝子が同定できた。
内容
SMART-Seq HT Kit（製品コード 634455、634456、634437、634438、634436）
- Box 1：Control Total RNA (1 μg/μl)
- Box 2：SMART-Seq HT Oligonucleotide
3' SMART-Seq CDS Primer II A
RNase Inhibitor (40 U/μl)
One-Step Buffer
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
SeqAmp DNA Polymerase
10X Lysis Buffer
Elution Buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.5)
Nuclease-Free Water
SMART-Seq HT Lysis Components（製品コード 634439）
3' SMART-Seq CDS Primer II A10X Lysis Buffer
SMART-Seq HT PLUS Kit（製品コード R400748）
- SMART-Seq HT Kit （製品コード 634456）
- SMART-Seq Library Prep Kit
10XFE
FE Dilution Buffer
Lib Prep Buffer
Lib Prep Enzyme
Rxn Enhancer
Adapters
Stem-Loop
Amplification Buffer
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (5 U/μl)
Nuclease-Free Water - Unique Dual Index Kit
48回用（製品コード R400748）
Unique Dual Index Kit - 48U （製品コード R400744）
保存
SMART-Seq HT Kit
Box 1：－70℃
Box 2：－20℃
SMART-Seq Library Prep Kit, Unique Dual Index Kit ： －20℃
Box 1：－70℃
Box 2：－20℃
SMART-Seq Library Prep Kit, Unique Dual Index Kit ： －20℃
本製品以外に必要な試薬、機器（主なもの）
下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。
- シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
- 8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
- フィルターピペットチップ： 10 μl、20 μlおよび200 μl
- 微量遠心機（1.5 mlチューブ用、0.2 mlチューブまたはストリップ用）
- 96ウェルプレート用遠心機
セルソーティング
- 8 –tube strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat No.AB0264）またはセルソーティングに適したPCR tube strips, 96-well plates
- （オプション）BD FACS Pre-Sort Buffer（BD社, Cat No. 563503）
- チューブ・プレート用クーリングブロック（－20℃で保存してあらかじめ冷やしておく）
- Adhesive PCR Plate Foils（Thermo Fisher Scientific社, Cat No. AB-0626）
- ドライアイス（細胞の凍結用）
- （オプション）SMART-Seq HT Kit Lysis Components（製品コード 634439）
One-Step RT PCR増幅およびバリデーション
- Hot-Lid PCRサーマルサイクラー
- High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Cat. No. 5067-4626)
- Agilent 2100 Bioanalyzer: DNA 1000 Kit (Agilent, Cat. No. 5067-1504)
- Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Cat.No. 1402-4700）
- Nuclease-free low-adhesion1.5 ml tubes (USA Scientific社 Cat.No. 1415-2600) またはLoBond tubes (Eppendorf, No.022431021)
SPRI Bead精製
- Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter社; 5 ml, Cat.No. A63880、60 ml, Cat.No. A63881）
- Magnetic Separation Device
- 12～24 サンプル用
0.2 ml チューブ：SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip ：製品コード 635011）など
0.2 mlチューブまたはストリップ用遠心機 - 24～96 サンプル用
96-well フォーマット用：Magnetic Stand-96 (Thermo Fisher Scientific社 Cat.No.AM10027)など
96-well V-bottom Plate (500 μl; VWR社, Cat. No. 47743-996)
PCR plate seals (Thermo Fisher Scientific社 Cat.No.AB0558)
96-well plate用遠心機 - 1.5 ml用
Magnetic Stand（製品コード 631964）または NEB Magnetic Separation Rack (NEB社, Cat.No.1506S)
（精製前にNexteraシーケンス用ライブラリーをプールした場合に必要）
- 12～24 サンプル用
- 80％ Ethanol
SMART-Seq Library Prep Kitによるライブラリー調製
- Nuclease-free, PCR grade, thin-wall PCR strips (0.2-ml PCR 8-tube strip; Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0264)
- Nuclease-free low-adhesion 1.5 ml tubes (USA Scientific社, Cat No. 1415-2600)または、DNA LoBind tubes (Eppendorf, Cat. No. 022431021)、Benchtop cooler, VWR CryoCoolers (VWR社, Cat. No. 414004-286)など
Application
シングルセルRNA-seq実験を成功させるための5つのTips
セルソーターを用いたシングルセルRNA-Seq実験を成功させるための5つのTips
Ca2＋イメージングと1細胞RNA-Seqを組み合わせ、ホヤの運動神経節のCa2＋振動細胞を解析。Ca2＋と神経回路発生の関係を探る（イルミナHP）。
Technical Notes
High-throughput single-cell mRNA-seq
SMART-Seq® HT PLUSキットとNextera XTキットの性能比較（英語）
RNA-seqを成功させるためのコツ（英語）
RNA-seqのヒント（英語）
コントロールサンプルの準備（英語）
がんアプリケーションにおけるシングルセル解析（英語）
アルツハイマー病のシングルセル解析（英語）
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- 注意事項
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