簡単操作で5 kbまでのノックインドナー用一本鎖DNAを効率的に調製可能
- CRISPR/Cas9ノックインドナー用長鎖一本鎖DNA（ssDNA）調製キット
- 500 bases～5 kbまでのssDNAが調製可能
- 独自技術の「Strandase処理」で二本鎖を一本鎖化
- クローニング操作、ゲル抜き精製不要の簡単プロトコール
- 二本鎖DNAに比べてランダムインテグレーションが少ないため、ゲノム編集効率がUp
- 反応系の改良により、より効率的なssDNA調製が可能に
製品説明
CRISPR/Cas9でのノックインはドナーDNAを作製し、主にCas9-sgRNA複合体もしくはCas9-sgRNA発現ベクターと共に導入することで起こる。
ドナーDNAとして二本鎖DNA（dsDNA）よりも一本鎖DNA（ssDNA）を使用したほうが、ランダムインテグレーションが起きにくく、細胞毒性が低いなど多くの利点があることが近年示されているが、長鎖のssDNAは作製が難しいため使用が制限されていた。
本製品は、CRISPR/Cas9のノックインドナーDNAとして使用できる、500 bases～5 kbまでの長鎖ssDNAを調製するためのシステムである。独自技術のStrandase処理により、PCR産物のセンス鎖またはアンチセンス鎖を選択的に分解することで、簡単な操作で最終的にセンス鎖もしくはアンチセンス鎖のssDNAが調製できる。
本製品にはssDNAを50回（センス鎖、アンチセンス鎖それぞれ25回）作製するために必要な試薬と、ssDNA精製用のNucleoSpin Gel and PCR Clean-upおよびバッファーが含まれている。
反応系の改良により、従来製品Guide-it Long ssDNA Production System（製品コード 632644：終売）よりもStrandase処理の効率がさらに改善されており、これまで困難だったターゲットからも、より効率的なssDNA調製が可能となっている。
まず、dsDNAテンプレートをクローニング、fusion PCR、または他の方法により調製する。テンプレートは目的遺伝子の他に、目的遺伝子を挿入する左右の隣接配列と相同のアームを含む必要がある。
次に、dsDNAテンプレートを片側のみリン酸化プライマーを使用してPCRを行い、異なる2種類のdsDNA産物を作製する（これらはそれぞれ、センス鎖ssDNA、アンチセンス鎖ssDNA作製のための鋳型となる）。
Strandase Mix Aを加えてセンス鎖もしくはアンチセンス鎖を分解する。Strandase Mix Aは5’がリン酸化された鎖だけを分解するので、センス鎖側またはアンチセンス鎖側を選択的に分解できる。次にStrandase Mix Bを加えて最終の分解を行い、ssDNAが得られる。
得られたssDNAをクリーンアップし、CRISPR/Cas9でのノックイン実験に使用する。
センス鎖、アンチセンス鎖両方のssDNAを調製し、それぞれ別々にノックイン実験を行うことを推奨する。
AAVSにあるターゲットサイトのホモロジーアーム（600 bp）を含んだEF1αプロモーターおよびAcGFP1を含むssDNAドナーを作製し、ノックイン実験を行った。
GFP陽性クローンを単離した後、挿入されたサイトの正確性を調べるためにシーケンスを行った。その結果、すべてのクローンで目的遺伝子が正しい位置に挿入され、つなぎ目に変異が入っていないことが確認できた。
Panel A：GAPDHまたはTyr geneへAcGFP1を挿入するための長鎖ssDNAを作製した。
一部のssDNAは、本来あるべきssDNAの長さより多少短くなっていた。
Panel B：CCR5 locus用の2～5 kbまでのssDNAの作製を行った。
一部のssDNAは、本来あるべきssDNAの長さより多少短くなっていた。
従来製品Guide-it Long ssDNA Production System (v1)では高純度のssDNAの調製が困難だったいくつかのdsDNAテンプレート（#1～#5）について、本製品（v2）を使用してssDNAを調製し、電気泳動で比較した。
すべてのケースにおいて、本製品Guide-it Long ssDNA Production System v2では、従来製品に比べて目的外の産物の少ないクリアなssDNAのバンドが確認でき、より完全で均一な選択的分解ができていることが示唆された。
Panel A：GAPDHのexon 8領域にGAPDHとインフレームで融合するようにAcGFPを挿入するためのドナーssDNAテンプレートを本キットを使って作製した。
Panel B：HEK293細胞へ変異導入後のフローサイトメトリーの結果を示した。
直鎖状のdsDNAをドナーとして使用した場合は、Cas9とsgRNAの非存在下でも緑色の蛍光が観察された。一方センス、アンチセンス鎖のドナーssDNAテンプレートを使用した場合は、テンプレートがCas9とsgRNAが共に導入された場合のみ、蛍光が観察され、Cas9とsgRNA非存在下では、ほとんど蛍光は観察されなかった。
hiPSC18のtubulin領域にAcGFP1をノックインする実験を行った。
ノックインドナーをssDNA、もしくはdsDNAで用意し、Cas9＋sgRNAと一緒にエレクトロポレーションで導入した。Cas9を加えない実験も同時に行った。
ドナーDNAは、インサートの両側に350 bの相同アームを持つ構造で長さは約1.5 kbである。
dsDNAドナーを用いた場合は、Cas9存在下・非存在下どちらにおいても顕著な毒性が見られた。
内容
Guide-it Long ssDNA Production System v2（製品コード 632666）
- Guide-it Long ssDNA Strandase Kit v2（製品コード 632667）＊
PrimeSTAR Max Premix (2X) 625 μl×4 Strandase Mix A 250 μl Strandase A/B Buffer (10X) 250 μl Strandase Mix B 50 μl Digestion Enhancer (5X) 500 μl RNase Free Water 1 ml×5 2-kb Control Template (2 ng/μl) 50 μl Control Primer Mix (16 μM) 50 μl - NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up（製品コード 740609.50） 50回×2
- Buffer NTC（製品コード 740654.100） 125 ml
保存
| Guide-it Long ssDNA Strandase Kit v2（製品コード 632667） | －20℃ |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up（製品コード 740609.50） | 室温 |
| Buffer NTC（製品コード 740654.100） | 室温 |
本製品以外に必要な試薬（主なもの）
ターゲット増幅用プライマー
（5’リン酸化プライマー 2種類、通常のプライマー 2種類 計4種類必要）
（5’リン酸化プライマー 2種類、通常のプライマー 2種類 計4種類必要）
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