投与した合成siRNAの残存量を測定

Synthetic siRNA Quantitation Kit

qPCR試薬の製品名変更について
  • total RNA中のsiRNAをSYBR Green I 検出リアルタイムPCRで簡便に定量
  • 3' dTTオーバーハングをもつsiRNAのみを特異的に測定
  • 106コピーから検出可能
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR 6142 6142 Synthetic siRNA Quantitation Core Kit
  • ライセンス
30反応分 ¥55,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR RR861A RR861A Synthetic siRNA Quantitation Kit (with SYBR® Premix Ex Taq II Tli)
  • ライセンス
1 Set ¥90,000
6142+RR820Aのセット品

製品説明

動物や細胞にsiRNAを投与しRNA干渉による特定遺伝子のノックダウン効果を検証することにより、医薬品としてのsiRNAの利用が検討されている。
本製品は合成siRNAの定量を目的としたコアキットで、リアルタイムPCR解析と組み合わせることにより、投与した合成siRNAの残存量を、細胞、組織、血液などから抽出したtotal RNAをサンプルとして測定することができる。
siRNAを化学合成する際には、一般的に3’末端にデオキシチミン(dT)2塩基のオーバーハングを付加する。本製品では、この3’オーバーハングにポリデオキシアデニン(ポリdA)を付加した後、特別に設計したOligo dT Primerを用いて逆転写反応を行うことにより、total RNA存在下でも合成siRNA分子から相補的なcDNAを調製することができる。調製されたcDNAを鋳型として、SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)などを用いたSYBR Green I検出リアルタイムPCRを行うことにより、合成siRNAの高感度な定量を行う。
Synthetic siRNA Quantitation Kit (with SYBR Premix Ex Taq II Tli)(製品コード RR861A)は、本製品(製品コード 6142)とSYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(製品コード RR820A)のセット品である。

<注意> 本製品は、3’オーバーハングがデオキシチミンd(TT)である合成siRNAの定量に使用できる。
3’オーバーハングとしてd(TT)以外のDNA配列が付加された合成siRNAの場合、配列を変更したOligo dT Primerを別途用意すれば、本製品を使用できる。
3’オーバーハングの付加がない、または3’オーバーハングがRNAである合成siRNAの場合は、本製品を使用できない。

内容

(30反応分)*1
1. Terminal Transferase Buffer390 μl
2. Terminal Transferase30 μl
3.dATP150 μl
4. Recombinant RNase Inhibitor30 μl
5. Oligo dT Primer *2150 μl
6. RT Buffer270 μl
7. RT Enzyme Mix30 μl
8. Universal Primer(10 μM)120 μl
9. EASY Dilution(for Real Time PCR)1 ml
10. Control siRNA(20 nM)10 μl
11. Control Primer(10 μM)20 μl

*1 poly dA tailingおよび逆転写反応30反応分、リアルタイムPCR用Universal Primer 120反応分を含む。
*2 本製品用に設計したOligo dT Primerである。

保存

-20℃

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

  • リアルタイムPCR用増幅装置および専用チューブ、専用プレート
     Thermal Cycler Dice Real Time System II(製品コード TP900)など
  • リアルタイムPCR 用siRNA配列特異的プライマー
  • リアルタイムPCR 試薬
    本製品と組み合わせ可能なリアルタイムPCR関連製品
     SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(製品コード RR820S/A/B)
     SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)(製品コード RR420S/A/B)
  • 0.2 mlマイクロチューブ(PCRチューブ)
  • マイクロピペットおよびチップ(オートクレーブ処理したもの)
  • RNA抽出キット(RNAiso Plus(製品コード 9108/9109)など)

原理

合成siRNAからのcDNA調製

  1. poly dA tailing反応
    合成siRNAを熱変性により一本鎖にし、合成siRNAの3’末端に付加されているデオキシチミンd(TT)にポリdAを付加する。


  2. 逆転写反応
    付加されたポリdA配列にOligo dT Primerをアニーリングさせた後、逆転写反応を行う。
    このOligo dT Primerには、後のリアルタイムPCRを行う際に利用されるUniversal配列が付加されている。



    <注意> 本製品のOligo dT Primerは、3’オーバーハングがd (TT)である合成siRNA用に設計されたものです。3’オーバーハングとしてd (TT)以外のDNA配列が付加されたsiRNAの場合、配列を変更したOligo dT Primerを別途用意する必要がある。配列については、弊社テクニカルサポートラインまでお問い合わせください。
リアルタイムPCRによる定量

調製されたcDNAを鋳型として、SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)* 1(製品コード RR820S/A/B)を用いてリアルタイムPCRを行う。
増幅にはUniversal Primer* 2とsiRNA 配列特異的プライマー* 1を使用する。SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) では、Hot Start PCR用酵素TaKaRa Ex Taq HSを使用しリアルタイムPCRを行うため、反応液調製時の非特異的増幅による影響の少ない、高感度な定量PCRが可能である。

*1 別途用意する。
*2 本製品に含まれている。

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