O157：H7をはじめとする腸管出血性大腸菌（EHEC）は、血便と激しい腹痛を伴う出血性大腸炎、さらには溶血性尿毒症症候群を引き起こす病原性大腸菌の一群である。これらの重篤な症状の原因は、EHECが産生する細胞毒素であるベロ毒素である。EHECの検出においては、まずベロ毒素遺伝子（およびeae遺伝子）の保有状況によるスクリーニングを行い、ベロ毒素遺伝子陽性であれば、O抗原型の遺伝子タイピングを行った後、分離培養を行う方法が効率的であるとされている。

本キットは、O抗原型の内、主要な7血清型（O26、O103、O111、O121、O145、O157、O165）のタイピングに使用する。さらに、ベロ毒素1型、ベロ毒素2型、eae遺伝子も同時検出することが可能である。
これらの遺伝子をマルチプレックスPCRにより同時に検出する。

＊ 本キットの開発には、宮崎大学農学部畜産草地科学科 動物衛生微生物学分野 井口純准教授にご協力頂きました。

（50回反応分、50 μl反応系）

○ 1．	2×Multiplex PCR Buffer（Mg2＋, dNTP plus）	625 μl×2
○ 2．	Multiplex PCR Enzyme Mix	12.5 μl
● 3．	Primer Mix (EHEC O antigens) 5×conc.	500 μl
○ 4．	dH2O	1 ml
● 5．	Control Template 1	100 μl
● 6．	Control Template 2	100 μl

【コンポーネントの説明】
2×Multiplex PCR Buffer（Mg^2＋, dNTP plus）：
　　PCR反応用バッファーである。反応に必要なdNTP Mixture、Mg^2＋を含む。

Multiplex PCR Enzyme Mix：
　　PCR酵素である。

Primer Mix (EHEC O antigens)：
　　以下の遺伝子検出用のプライマーを含む。

ターゲット遺伝子	増幅サイズ
O26のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子	241 bp
O103のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子	716 bp
O111のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子	451 bp
O121のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子	193 bp
O145のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子	132 bp
O157のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子	292 bp
O165のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子	1,042 bp
ベロ毒素1型遺伝子（stx1）	348 bp
ベロ毒素2型遺伝子（stx2）	584 bp
eae遺伝子	881 bp

Control Template 1：
　　O26、O103、O111、O121、O145、O157、O165の陽性コントロール

Control Template 2：
　　ベロ毒素1型、ベロ毒素2型、eae遺伝子の陽性コントロール

－20℃

【試薬】

1. 滅菌精製水
2. PrimeGel Agarose PCR-Sieve（製品コード 5810A）
3. 電気泳動用buffer
   TBE（Tris-borate-EDTA） powder（製品コード T905）
4. DNAマーカー
   100 bp DNA Ladder（製品コード 3407A/B）
   またはφX174-Hinc II digest（製品コード 3406A/B）
5. Loading buffer（6×：36％ glycerol、0.05％ bromophenol blue、0.035％ xylene cyanol、30 mM EDTA）（4．に記載のDNAマーカーには添付されている。）
6. DNA染色剤
   SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain（製品コード 5760A/5761A）
   またはエチジウムブロマイド

【機器】

1. ヒートブロック（95℃まで温度を上げられるもの）
2. 1.5 mlチューブ対応型遠心機
3. サーマルサイクラー
   TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch（製品コード TP350）
   TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient（製品コード TP600）など
4. 電気泳動装置
   Mupid-2plus（製品コード M-2P）
   Mupid-exU（製品コード EXU-1）など
5. UV トランスイルミネーター（300 nm 前後のもの）
6. 電気泳動ゲル撮影装置（SYBR Green Iを使用する場合は、専用のフィルターが必要）

【その他】

1. PCR 用チューブ
   0.2 ml Hi-Tube Dome Cap（製品コード NJ200）など
2. 200 μl、20 μlマイクロピペット
3. マイクロピペット用チップ
4. アガロースゲル染色用トレイ（SYBR Green Iを使用する場合は、ポリプロピレン製容器を使用する。）

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分野別の試薬選択フロー
手法別の試薬選択フロー

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