in vitro transcriptionによるsgRNAの調製およびsgRNAの有効性の確認

Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription and Screening System

  • CRISPR/Cas9ゲノム編集用のsgRNAをin vitro transcriptionで調製
  • 簡便なプロトコールで高品質sgRNAが調製可能。しかも高収量(12 μg以上)
  • 得られたsgRNAはトランスフェクション、エレクトロポレーションに使用可能
  • Screening Kitに含まれるCas9タンパク質と組み合わせることで、実サンプルを用いることなくin vitroでのsgRNAの有効性確認(Screening)が可能
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別)
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参考
資料
CLN 632635 Z2635N Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit
  • 「CRISPR/Cas9 スタートアップ関連製品」 セットで25%OFFキャンペーン
  • ライセンス
50回 ¥150,000
2017/11/01~
2017/11/24

説明書・データシート・ベクター情報
CLN 632636 Z2636N Guide-it™ Complete sgRNA Screening System
  • ライセンス
50回 ¥180,000
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 632639 Z2639N Guide-it™ sgRNA Screening Kit
  • ライセンス
50回 ¥78,000
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 632638 Z2638N Guide-it™ IVT RNA Clean-Up Kit
50回 ¥73,000
説明書・データシート・ベクター情報

※色文字での表示は、キャンペーン価格およびそのキャンペーン期間です。

製品説明

Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit(製品コード 632635)は、in vitro transcription反応によりsgRNAを調製するキットである。従来品のプロトコールやコンポーネントを改良することにより、簡便に高品質sgRNAを高収量(12 μg以上)で調製できる。sgRNAの精製にスピンカラム式の精製キットGuide-it IVT RNA Clean-Up Kit(製品コード 632638)を採用しており、フェノール/クロロホルムを使わずに高純度精製が行える。精製したsgRNAは、そのまま細胞へのトランスフェクションやエレクトロポレーションに使用できる。
Guide-it Complete sgRNA Screening System(製品コード 632636)は、Guide-it sgRNA In Vitro Transcription KitとCas9タンパク質を含むGuide-it sgRNA Screening Kit(製品コード 632639)から構成されている。本キットを使って調製したsgRNAと添付のCas9タンパク質を組み合わせることで、sgRNAの有効性を実サンプルを用いることなくin vitroで確認できる。事前にsgRNAの有効性を確認することで、ワークする配列を実際の変異導入実験に用いることができ、失敗リスクを軽減できる。有効性を確認するためのターゲット配列は、添付のPCR酵素を使用してPCRによって調製するが、ダイレクトPCRが可能なTerra PCR Mixを採用しているので、サンプルからゲノムDNAを抽出する手間を省くことができる。調製したターゲット配列にsgRNAとCas9タンパク質を作用させ、アガロースゲル電気泳動によって切断効率(有効性)を確認する。

ここで紹介している製品シリーズは、従来品と製品名は同じであるが、いくつか改良点や変更点がある。
<従来品からの改良点・変更点>
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit
  • 容量が10回から50回に
  • 転写開始点の変更により、sgRNAの収量が従来品の約3倍(12 μg以上)
  • 鋳型DNA(sgRNA-encoding template)のPCR増幅にPrimeSTAR Maxを採用することで非特異的増幅が減り、原則ゲル切り出し精製は不要
  • sgRNAの精製にカラム式のClean-Up Kitを採用することでフェノール/クロロホルム抽出が不要に

Guide-it sgRNA Screening Kit
  • 容量が30回から50回に
  • ターゲットDNA(DNA cleavage template)の調製にTerra PCR Mixを採用することで細胞からのダイレクトPCRが可能に
  • Cas9タンパク質溶媒のグリセロール濃度が10%から50%に


図1. Guide-it sgRNA In Vitro Transcription and Screening Systemのフローおよびキット構成



図2. Guide-it sgRNA In Vitro Transcription and Screening Systemの操作ステップの概要



図3. 他社キットとの合成sgRNAの品質比較
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kitで調製したsgRNAと他社キットで調製したsgRNAを比較した。Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kitで調製したsgRNAは全てシングルバンドとなっており、他社キットに比べて高品質であった。



図4. sgRNAの収量と品質
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kitを用いてsgRNAを調製(反応条件:20 μl、37℃、4時間)し、NanoDrop spectrophotometerでsgRNAの収量を調べた(パネルA)。
また、Agilent Bioanalyzerを用いてsgRNAの品質を調べた(パネルB)。

内容

Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit (製品コード 632635)
・Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Components v2
Guide-it Scaffold Template (1 ng/μl)50 μl
Guide-it In Vitro Transcription Buffer350 μl
RNase Free Water1 ml
Guide-it T7 Polymerase Mix (33 U/μl)150 μl
PrimeSTAR Max Premix (2X)625 μl
Recombinant DNase I (RNase-Free) (5 U/μl)100μl
•Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit(製品コード 632638)

Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit(製品コード 632638)
RNase Free Water13 ml
IVT Binding Buffer3 ml
IVT RNA Clean-Up Spin Column50個
IVT Wash Buffer6 ml×2
Collection Tubes (2 ml)50個

Guide-it Complete sgRNA Screening System (製品コード 632636)
・Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit(製品コード 632635)
・Guide-it sgRNA Screening Kit(製品コード 632639)

Guide-it sgRNA Screening Kit (製品コード 632639)
Guide-it Recombinant Cas9 Nuclease (500 ng/μl)25 μl
15X Cas9 Reaction Buffer50 μl
15X BSA50 μl
Control sgRNA (50 ng/μl)15 μl
Control Fragment (20 ng/μl)150 μl
Terra PCR Direct Polymerase Mix (1.25 U/μl)50 μl
2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2+, dNTP)1.25 ml
RNase Free Water
5 ml
Extraction Buffer 15 ml
Extraction Buffer 20.5 ml

保存

Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Components v2:-20℃
Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit:室温
Guide-it sgRNA Screening Kit:-20℃

キット以外に必要な機器、試薬

・96~100%エタノール
・イソプロパノール
・NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific社. No. ND-2000)または同等品

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