正確さが要求される増幅に

Pyrobest™ DNA Polymerase

  • ●反応用バッファー添付+dNTP
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR R005A R005A Pyrobest™ DNA Polymerase
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • カスタム製造について
125 U ¥29,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR R005B(A×4) R005B(A×4) Pyrobest™ DNA Polymerase
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • カスタム製造について
500 U ¥92,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

本製品は、Pyrococcus sp.由来の3'→5' exonuclease活性(proof reading 活性)を有する耐熱性α型DNAポリメラーゼである。Pyrococcus furiosus由来のPfu DNAポリメラーゼや、Vent DNAポリメラーゼと同等の正確性の高い増幅を行うことができ、しかもTaq DNAポリメラーゼと同程度の増幅効率がある。また、TaKaRa TaqなどのTaq DNAポリメラーゼとは異なり、hot start法を用いなくても非特異的増幅が抑えられるのも特長である。

内容

(125 U)
Pyrobest DNA Polymerase 125 U
10×Pyrobest Buffer II (10 mM Mg2+ plus) 500 μl
dNTP Mixture 400 μl

保存

-20℃

形状

50 mM Tris-HCl (pH8.2)
0.1 mM EDTA
1 mM DTT
0.1% Tween 20
0.1% NP-40
50% Glycerol

添付dNTP Mixture*

濃度 各2.5 mM
形状 水溶液(ナトリウム塩)pH7~9
純度 各98%以上

* dATP、dCTP、dGTP、dTTPの等モル混合物で、希釈せずにそのままPCR反応に用いることができる。

活性の定義

活性化サケ精子DNAを鋳型/プライマーとして用い、下記の活性測定用反応液中にて74℃において、30分間に10 nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を1 Uとする。

活性測定用反応液組成

20 mM Tris-HCl 緩衝液 (pH8.3, 37℃)
10 mM KCl
6 mM (NH4)2SO4
2 mM MgCl2
0.1% Triton X-100
0.001% BSA
各 200 μM dATP・dGTP・dCTP
100 μM 3H]TTP
0.4 mg/ml 活性化サケ精子 DNA

純度

●10 Uの本酵素と0.6 μgのλ-Hind III分解物を74℃、1時間反応させてもDNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。
●10 Uの本酵素と0.6 μgのsupercoiled pBR322 DNAを74℃、1時間反応させてもDNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。
●10 Uの本酵素と0.6 μgのλDNAを74℃、1時間反応させてもDNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。

一般的なPCR反応液組成(Total 50 μl)

Pyrobest DNA Polymerase(5 U/μl) 0.25 μl
10×Pyrobest Buffer II 5 μl
dNTP Mixture(各2.5 mM) 4 μl
Template<500 ng
Primer 10.2~1.0 μM
(final conc.)
Primer 20.2~1.0 μM
(final conc.)
滅菌精製水up to 50 μl

PCR条件 (例)

1 kb DNA を増幅する場合

98℃、10 sec
68℃、1 min
30 cycles
または
98℃、10 sec
55℃、30 sec
72℃、1 min
30 cycles

(注意)
・基本的には2ステップPCRをお勧めします。プライマーのTm値が低く、2ステップPCRが難しい場合には、3ステップPCRをお試しください。
・変性の条件は、使用機種とチューブの種類にあわせて設定してください。変性時間の設定の目安は、94℃の場合は20 sec~30 sec、98℃の場合は1sec~10sec です。

PCR産物について

Pyrobest DNA polymeraseを用いて増幅したPCR産物の多くは平滑末端である。したがって、そのPCR産物をそのまま(必要に応じてリン酸化して)平滑末端のベクターにクローニングすることが可能である。

PCR 検定

●大腸菌ゲノムDNAを鋳型としたPCR反応(増幅産物8 kb)において良好な増幅が見られることを確認している。
●ヒトゲノムDNAを鋳型としたsingle copy gene(p53遺伝子)のPCR反応(増幅産物2.9 kb)において良好な増幅が見られることを確認している。

用途

Polymerase Chain Reaction(PCR)法によるDNA増幅、特に正確性が要求されるPCRに最適。

使用上の注意

イノシンを含むプライマーの使用は避けてください。
● 弊社では、さまざまな特長をもつPCR酵素を用意しています。
  用途に応じて選択してください。
⇒ PCR Enzyme選択フローチャート

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注意事項
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