Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNA

本製品は、mRNAを用いた無細胞タンパク質合成試薬です。タンパク質翻訳に必要な全ての成分（ヒト細胞由来のリボソーム、翻訳開始および伸長因子、tRNAなど）が含まれているため、単一のチューブ内において、タンパク質をコードするキャップ化mRNA^＊1を本製品へ添加し、32℃で数時間インキュベートするだけでタンパク質を合成することができます。




上記のとおり本製品を用いた無細胞発現系は手順が簡便なため、従来の細胞ベースの発現系と比較して作業時間の大幅な短縮が可能になります。
これにより目的タンパク質の生産だけでなくmRNA構築物評価の迅速な手段にもなるため、ワクチン開発などのために設計されたmRNA構築物のスクリーニングに適しています。^＊3
また、本製品はeIF4Gのような200 kDa近くの長鎖配列（2,000 aa＝6,000 nt）まで合成が可能です。






■ 5’-Cap依存的翻訳と経時的発現量
本製品に、キャップ化mRNA^＊4および非キャップ化RNA（どちらもFLuc RNA配列）をそれぞれ2 μg添加し、32℃で0、1、2、3および5時間インキュベートした。
その結果、キャップ化mRNAを添加した場合のみ、目的タンパク質の発現が確認された。
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図1．5’-Cap依存的翻訳と経時的発現量


■ RNA配列（3’ UTRの種類）が翻訳効率に与える影響と細胞発現との相関
4種類のキャップ化FLuc mRNA（※）を使用し、本製品を用いた無細胞発現と、HEK293T細胞を用いた細胞発現の相関を評価した。
その結果、無細胞発現系と細胞発現系の比較において、FLucタンパク質の発現レベルに相関が見られた。
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図2. 本製品を用いた無細胞発現系と細胞発現系の相関

※ 本実験で使用したキャップ化FLuc mRNAは、下記4種類の配列のいずれかをFLuc遺伝子の下流（下図オレンジ位置）に挿入した鋳型DNAを用いて作製した。

• ヒトα-globin由来の3’ UTR配列
• ヒトβ-globin由来の3’ UTR配列
• ヒトAES遺伝子由来の3’ UTR配列
• 肝炎ウイルス由来のWPRE配列

Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNA　　　180 μl

－80℃
※本製品は受領後、直ちに－80℃で保管してください。－80℃より高い温度で保管すると性能が低下する場合があります。
※一度に使い切らない場合は、凍結融解による性能低下を避けるため、最初の融解時に小分け分注して保存することをお勧めします。

1. Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNAを氷上で融解し、穏やかにピペッティングしてよく混合した後、0.2 mlチューブに18 μlを分注する。
2. 1.を32℃で5分間プレインキュベーションする。
3. 2.にCapped mRNA 2 μg^＊5と必要に応じてNuclease-free waterを加えて、Total 20 μlの反応液を調製する。
4. 反応液を穏やかにピペッティングしてよく混合した後、27～32℃で1～5時間^＊6インキュベーションする。

＊5 Capped mRNA量は2 μgを推奨します。目的タンパク質の産生が少ない場合は、添加量を変更してお試しください。
＊6 最適な反応温度と反応時間は目的タンパク質やmRNA構築物によって異なりますが、初回検討時は32℃で3時間の反応を推奨します。