CycleavePCR™ Mycoplasma Detection Kit

本製品はマイコプラズマの16S rRNA遺伝子をターゲットとして、リアルタイムPCR装置を用いてマイコプラズマを網羅的かつ特異的に検出するためのキットである。培養細胞によく見出されるものをはじめとして、少なくともMycoplasma属中の10種（M. arginini, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale, M. salivarium, M. fermentans, M. bovis, M. arthritidis, M. pirum, M. pneumoniae）およびAcholeplasma属中の1種（A. laidlawii）を感度よく検出することを確認している。

本キットの増幅反応にはHot Start PCR用酵素、TaKaRa Ex Taq HSを使用しており、反応液調製時などサイクル前のミスプライミングやプライマーダイマーに由来する非特異的増幅を防ぐことができる。
増幅産物の検出にはサイクリングプローブ法を採用している。この方法はRNAとDNAからなるキメラプローブとRNase Hの組み合わせによる高感度な検出方法で、非常に特異性の高い検出が可能である。プローブは片方の端が蛍光物質で、もう片方の端がその蛍光物質の発する蛍光を消光する物質（クエンチャー）で標識されている。このプローブは、インタクトな状態ではクエンチングにより蛍光を発することはないが、配列が相補的な増幅産物とハイブリッドを形成した後にRNase HによりRNA部分で切断されることにより、強い蛍光を発するようになる。この蛍光強度を測定することで、増幅産物量をモニターすることができる。本キットのプローブはマイコプラズマに特徴的な塩基に相補する塩基をRNAとしているため、マイコプラズマのみを特異的に高感度に検出することが可能である。

（50反応分；25 μl反応系）

1．	2×CycleavePCR Reaction Mix	625 μl
2．	Myco. Primer/Probe Mix（5×conc.）	250 μl	＊1
3．	RNase Free dH2O	1 ml
4．	Myco. Positive Control（1×106 copies/μl）	20 μl	＊2
5．	Proteinase K	50 μl

＊1	蛍光標識プローブを含んでいるので、遮光に留意する。
＊2	リアルタイムPCRコンポーネント（1～3）に誤って混入すると、正しい検出反応を行うことができなくなる。付属のキットケースに移し、別に保存する。

－20℃

Myco. Positive Controlを鋳型としてMyco. Primerで増幅されたPCR産物は、FAM標識プローブ検出領域とROX標識プローブ検出領域の両方を含むため、FAM標識プローブでもROX標識プローブでも検出される。サンプル中に阻害物質が含まれているかどうかを確認するためには、使用するサンプルにMyco. Positive Controlを加えて、Control実験を実施し、ROXフィルターで検出の有無を確認する。

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