SMART-Seq^® Single Cell Kit

SMART-Seq Single Cell Kitは、シングルセルや核からのRNA-Seqに適した高感度で再現性の高いcDNA調製キットである。RNAを抽出することなく、シングルセルから直接、高品質な全長のcDNAを調製することができる。調製したcDNAはllluminaプラットフォーム用のライブラリー調製キットに使用できる。本キットは、SMART-Seqテクノロジーを改良してシングルセル解析専用に設計されており、SMART-Seq2などの既存の方法、およびタカラバイオの従来のキット（SMART-Seq v4）に比べて、はるかに優れたシングルセルRNA-Seqライブラリーの作製が可能となる。本キットは、2 pgのtotal RNA、およびRNA含有量が低いことが知られている末梢血単核細胞（PBMC）などのシングルセルで性能を確認済みである。

リンパ芽球様細胞株GM12878のシングルセルからSMART-Seq Single Cell Kit (SSsc；18サンプル) および SMART-Seq2 法 (SMART-Seq2; 20サンプル)によってcDNAを調製し（各19サイクルで増幅）、RNA-Seqライブラリーを作製してシーケンス解析を行った。全てのサンプルは175万ペアエンドリードにノーマライズした。

パネルA：cDNAの調製方法によってマッピング結果が異なっており、SMART-Seq2ではミトコンドリアゲノムへのマッピング率が多く、遺伝子同定に使用できるリード数が少なかった。

パネルB：SMART-Seq Single Cell Kitでは、SMART-Seq2に比べて多くの遺伝子が検出された。

パネルA：リンパ芽球様細胞株GM22601の12個のシングルセルからSMART-Seq Single Cell Kit (SSsc)、またはSMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing（SSv4；製品コード 634888など）を用いてcDNAを調製した（各19サイクルで増幅）。cDNAの収量は、SMART-Seq Single Cell Kitの方が大幅に多い結果となった。

パネルB：シングルドナーから採取したPBMC約50個のシングルセルからSMART-Seq Single Cell Kit、またはSMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for SequencingでcDNAを調製し、RNA-Seqライブラリーを作製してシーケンス解析を行った。解析に使用したリード数に関係なく、SMART-Seq Single Cell KitではSMART-Seq v4の1.6倍以上の遺伝子が検出された。
SMART-Seqテクノロジーをシングルセル解析用に改良したSMART-Seq Single Cell Kitの優れた感度が示された。

Panel A：SMART-Seq Single Cell Kit（終売）を使用して10 pgのマウス脳total RNAから3連でcDNAを作成した。 次に、SMART-Seq Single Cell PLUS Kit（終売）に含まれるSMART-Seq Library Prep KitまたはNextera XT Kitを使用して、Illumina社シーケンサー用のライブラリーを調製した。 ライブラリーを4M paired-end リードにノーマライズし、NextSeq500でシーケンスを行った。

Panel B：SMART-Seq Single Cell PLUS Kit（終売）はNextera XTより高収量のライブラリーが得られた。

Panel C：SMART-Seq Single Cell PLUS Kit（終売）は、Nextera XTと比較してより多くの遺伝子が同定できた。

SMART-Seq Single Cell Kit （製品コード 634470/634471/634472）

• Package 1
  Control Total RNA(1 μg/μl)
• Package 2
  10×Lysis Buffer
  RNase Inhibitor (40 U/μl)
  Nuclease-Free Water
  SMART-Seq sc TSO
  3'SMART-Seq CDS Primer II A
  SMARTScribe II Reverse Transcriptase
  SMART-Seq sc First Strand Buffer (5X)
  SeqAmp DNA Polymerase
  SeqAmp CB PCR Buffer (2X)
  PCR Primer
  Elution Buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.5)

SMART-Seq Single Cell Kit
Control Total RNA：－70℃
その他のコンポーネント：－20℃

完全長トランスクリプトーム解析を目的としたシングルセルからのcDNA合成

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

• シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
• 8連または12連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
• フィルターピペットチップ： 2 μl、20 μlおよび200 μl
• 微量遠心機（1.5 mlチューブ用、0.2 mlチューブまたはストリップ用）
• 96ウェル冷却ラック（IsoFreeze PCR Rack, MIDSCI社 Cat. No. 5640-T4、96-Well Aluminum Block, Light Labs社 Cat. No. A-7079　など）

セルソーティング

• 8-tube strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat No.AB0264）または使用する機器に適したPCR tube strips、96-well plates（iQ 96-Well PCR Plates,　Bio-Rad社 Cat. No. 2239441など）
• Microplate film（USA Scientific社 Cat. No. 2920-0010）ソーティング前のプレートシールに使用
• Aluminum single tab foil seal（USA Scientific社 Cat. No. 2938-4100）または cap strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0784/AB0850）
• 低速遠心機（96ウェルプレートまたはtube strip用）
• ドライアイス（細胞の凍結用）
• （オプション）BD FACS Pre-Sort Buffer（BD社 Cat No. 563503）
• （オプション）SMART-Seq HT Kit Lysis Components（製品コード 634439）または10X Lysis Buffer（製品コード 635013）

cDNA合成およびバリデーション

• Hot-Lid PCRサーマルサイクラー
• Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Cat.No. 1402-4700）など
• Nuclease-free-low adhesion1.5 ml tubes（USA Scientific社 Cat.No. 1415-2600）またはLoBond tubes（Eppendorf, No.022431021）など

SPRI Bead精製

• Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter社 5 ml, Cat.No. A63880、60 ml, Cat.No. A63881）
• 80％ Ethanol
• Magnetic Separation Device
  • 12～24サンプル用
    • 0.2 ml チューブ：SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip（製品コード 635011）など
    • 0.2 mlチューブまたはストリップ用遠心機
  • 24～96サンプル用
    • 96-well フォーマット用：Magnetic Stand-96（Thermo Fisher Scientific社 Cat.No.AM10027）など
    • 96-well V-bottom Plate（500 μl；VWR社 Cat. No. 47743-996）
    • PCR plate seals（Thermo Fisher Scientific社 Cat.No.AB0558）
    • 96-well plate用遠心機
  • 1.5 ml用（精製前にNexteraシーケンス用ライブラリーをプールした場合に必要）
    • Magnetic Stand（製品コード 631964）または NEB Magnetic Separation Rack（NEB社 Cat.No.1506S/1509S）

cDNA定量

• High Sensitivity DNA Kit（Agilent Cat. No. 5067-4626）または同等品

ライブラリー作製

• Nextera XT DNA Library Preparation Kit（Illumina社 Cat. No. FC-131-1024, FC-131-1096）
• Nextera XT Index Kit（Illumina社 Cat. No. FC-131-2001）または同等品