PrimeScript™ High Fidelity RT-PCR Kit

PrimeScript High Fidelity RT-PCR Kitは、total RNAあるいはmRNAから高い正確性でcDNAを合成するためのRT-PCR用キットである。
本キットの逆転写反応にはM-MLV由来のRTaseをベースにタカラバイオが独自に開発した逆転写酵素PrimeScript RTaseを、またPCRにはHigh Fidelity PCR酵素の決定版、PrimeSTAR Max DNA Polymeraseを用いている。PrimeSTAR Maxは最高レベルの正確性とTaq DNA Polymeraseに優る増幅効率を併せ持つプレミックスタイプの酵素で、鋳型量に対する適応性が改良されており、cDNAクローニングなど正確性が要求される重要な反応に安心して使用することができる。本キットの標準プロトコールである2ステップRT-PCRでは、次の様な特長を示す。

• 効率よく正確性の高いRT-PCR増幅産物が得られる。
• 標準的な逆転写反応温度（42℃）で、高次構造を取り得る鋳型RNAにも優れた伸長性を示す。
• 反応に使用できるtotal RNA量の許容範囲が非常に広く、使いやすい。

本キットは、プロトコールの一部を変更することで、1ステップRT-PCRにも利用可能である。

（50回用）^*1

1.	PrimeScript RTase（for 2 step）	25 μl
2.	5×PrimeScript Buffer	200 μl
3.	RNase Inhibitor （40 U/μl）	25 μl
4.	dNTP Mixture （10 mM each）	50 μl
5.	Oligo dT Primer （2.5 μM）	50 μl
6.	Random 6 mers （20 μM）	50 μl
7.	PrimeSTAR Max Premix （2×）	625 μl×2
8.	Control F-1 Primer*2 （20 μM）	10 μl
9.	Control R-1 Primer*3 （20 μM）	10 μl
10.	Positive Control RNA （2×105 copies/μl）	20 μl
11.	RNase Free dH2O	1 ml

*1　逆転写反応系20 μl → PCR 反応系50 μlの2ステップPCR　50回分
*2　Positive Control RNA 用上流センスプライマー
*3　Positive Control RNA 用下流アンチセンスプライマー

－20℃
＜注意＞PrimeSTAR Max Premix（2×）は10回程度の凍結融解では活性低下が見られないことを確認しているが、過度の凍結融解の繰り返しによる活性低下を防ぐため、一旦融解後はPCRチューブに25 μlずつ小分けし－20℃で保存することを推奨する。

GCリッチで変異が入りやすいThermus thermophilus HB8ゲノムDNAを鋳型として、任意に選択した10領域（増幅サイズはそれぞれ約500 bp）をPCR増幅後、ベクターにクローニングし、各配列について複数クローンをピックアップしてシーケンシングにより塩基配列を確認した。解析した総塩基数に対するエラー塩基数から、mutant frequencyを求めた。
PrimeSTAR Maxでは、解析した総塩基数542,580に対し、エラーはわずかに12塩基だった。
この方法は、実際のPCRに最も即したFidelityの求め方であり、正確性が重要な反応に安心して使用することができる。


図2．各酵素のFidelityの比較

2ステップRT-PCR（標準プロトコール）の場合

RNAテンプレート	全般
増幅サイズ	6 kbの良好な増幅を確認
逆転写酵素	PrimeScript RTase（至適温度42℃）
DNA Polymerase	PrimeSTAR Max DNA Polymerase（2×プレミックスタイプ）
RNase Inhibitor	必要（キットに含まれる）
1st strand cDNA 合成用プライマー	Random 6 mers、Oligo dT Primer、特異的下流プライマー より選択可

1ステップRT-PCR（オプションプロトコール）の場合

RNAテンプレート	全般
増幅サイズ	6 kbの増幅を確認
逆転写酵素	PrimeScript RTase（50℃で使用）
DNA Polymerase	PrimeSTAR Max DNA Polymerase（2×プレミックスタイプ）
RNase Inhibitor	必要（キットに含まれる）
1st strand cDNA 合成用プライマー	特異的下流プライマー（PCR時のアンチセンスプライマー）を使用 注：Randomプライマーや Oligo dTプライマーの使用は不可
操作	1本のチューブ内で連続的にRT-PCRを行う