Matchmaker™ Gold酵母ツーハイブリッド（Y2H）システム

Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid Systemは、GAL4ツーハイブリッドに基づき、未知のタンパク質-タンパク質間相互作用を検出、同定できる極めて優れたシステムである。本システムは、2つの栄養要求性レポーター（ADE2、HIS3）と、青白選択（MEL1；α-galactosidase）による判定に加え、感度の高い抗真菌抗生物質Aureobasidin A（AbA）（1）に対する耐性遺伝子（AUR1-C）をレポーターとして採用し、より簡単で厳密なスクリーニングが可能になった。
抗真菌抗生物質AbAは効果的に酵母を死滅させるが、Matchmaker Goldシステムで相互作用が見られる場合、酵母はAUR1-Cレポーター遺伝子の発現によりAbA耐性を獲得し、AbA添加培地でも生育する。本システムでは、3種類のGAL4応答性プロモーターで制御される4種類のレポーターを利用してスクリーニングを行うことで、偽陽性クローンの出現を低減させ、より確実な陽性クローン取得を可能にする。

Yeast Two-Hybridシステム概要
GAL4 Yeast Two-Hybridシステムは、タンパク質間相互作用を酵母を用いて簡便に検出、同定できる非常に優れた解析手法である。GAL4タンパク質が、DNA結合ドメイン（DNA-BD）と転写活性化ドメイン（AD）の2つのモジュールからなり、それぞれに分割しても、分割された2つのドメインがプロモーター上でごく近傍に位置する場合、強い転写活性能を示すことに基づいている（2、3）。
Matchmakerシステムでは、既知の“bait（おとり）”遺伝子、および、未知の“prey（獲物）”遺伝子を、それぞれDNA-BD、および、ADとの融合遺伝子となるようにベクター構築して酵母を形質転換する。baitタンパク質とpreyタンパク質の2つのタンパク質間で相互作用が見られる場合のみ、GAL4タンパク質の機能が回復し、酵母ゲノム中にコードされたレポーター遺伝子の転写が活性化される（図1）。Matchmaker Goldシステムでは、相互作用するbaitとpreyを発現する酵母クローンは、4つのレポーター遺伝子により検出、同定される（図2）。ライブラリーを用いるスクリーニングでは、レポーター遺伝子を発現する候補酵母クローンが選択培地上に生育するため、プラスミドを回収し、さらなる解析やシーケンスに用いることができる。


図1. Yeast Two-Hybridシステムの原理
ライブラリー由来のpreyタンパク質（GAL4 ADと融合して発現）が、baitタンパク質（GAL4 DNA-BDと融合して発現）と相互作用し、レポーター遺伝子の転写を活性化する。

Matchmaker Goldシステムの相互作用検出の厳密性は、本システムで用いる新しいY2HGold酵母株が、3種類のGAL4応答性プロモーター（MEL1、GAL1、GAL2）から転写される4種類のレポーター遺伝子AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1を保持していることに基づいている（図2、表1）。特に4つめのレポーター遺伝子として新しく採用されたAUR1-C遺伝子の発現は、感度の高い抗真菌抗生物質AbAに対する耐性を酵母に付与するため、従来の栄養要求性レポーター遺伝子のみによるクリーニングで生じていた多数の偽陽性クローンの出現を大幅に低減させることができる。
これらのレポーター遺伝子はY2HGold酵母株のゲノム上にコードされており、4種類のレポーター遺伝子を活用することで、ある種のpreyタンパク質が一つのレポーター遺伝子上流のプロモーター領域に非特異的に結合し、偽陽性クローンを生じる可能性を強力に排除する。
Matchmaker Goldシステムでは、まず2種類のレポーター遺伝子（AUR1-C、MEL1）による一次スクリーニングを行い、続いて4種類のレポーター遺伝子（AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2）により厳密な選択を行う2段階スクリーニングを推奨している（図4：実験例1）。


図2. Matchmaker Goldシステムの4種類のレポーター遺伝子
preyタンパク質とbaitタンパク質が相互作用すると、Y2HGold酵母株のゲノム中にコードされた3種類のGAL4応答性プロモーター（MEL1、GAL1、GAL2）制御下にある4種類のレポーター遺伝子の転写が活性化される。AbA耐性と2種類の栄養要求性レポーターによる培地上での生育の可否によって選択を行い、さらにα-galactosidaseレポーターによりX-α-Gal存在下でのコロニーの青色選択が行える。M1＝MEL1　G1＝GAL1　G2＝GAL2

表1. Matchmaker Goldシステムの4種類のレポーター遺伝子

レポータータイプ	レポーター遺伝子	相互作用陽性のクローンの形質
抗生物質耐性	AUR1-C	抗真菌抗生物質Aureobasidin A（AbA）に耐性
発色	MEL1	X-α-Gal存在下でコロニーが青色を呈す
栄養要求性	HIS3	ヒスチジンを含まない培地で生育可能
栄養要求性	ADE2	アデニンを含まない培地で生育可能

スクリーニング用のライブラリーには、Y187酵母株に形質転換済みの各種Mate & Plateライブラリーが利用できる。Mate & Plateライブラリーとbaitタンパク質を発現するY2HGold株を共に培養し接合させるだけで、簡単にライブラリーから相互作用タンパク質をスクリーニングできる。また、Make Your Own “Mate & Plate” Library Systemを用いて、ご自身のサンプルからY187酵母株にオリジナルのライブラリーを構築することも可能である。
Matchmaker Goldシステムと酵母に導入済みのMate & Plateライブラリーを用いることで、最先端で最も簡便なYeast Two-Hybridスクリーニングをお試しください。


図3. Mate & Plateプロトコール
preyタンパク質を発現するMate & Plateライブラリー（Y187酵母株に導入済み）を、baitタンパク質を発現するY2HGold株と共に培養して接合させることで、簡便にライブラリーから相互作用タンパク質をスクリーニングできる。

図4. 【実験例1】二段階スクリーニングにより高い割合で陽性クローンが得られるMatchmaker Goldシステム
マウスOct4転写因子のPOUドメインをbaitにもつY2HGold酵母株と、Mate & Plate Universal Mouse Normalized Libraryを用いてOct4結合タンパク質のスクリーニングを行った。2種類のレポーター遺伝子（AUR1-C、MEL1）による一次スクリーニング（選択培地：DDO+AbA, 60 ng/ml+X-α-Gal）により32コロニーをピックアップし、各コロニーを同じ選択条件培地（パネルA）ならびに4種類のレポーター遺伝子（AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2）による厳密な選択培地（QDO+AbA, 60 ng/ml+X-α-Gal）（パネルB）に植え継ぎした。その結果、32コロニーのうち25コロニーが4種類のレポーター遺伝子すべてが活性化されている陽性コロニーであることが確かめられた。
DDO＝Double dropout medium：SD/-Leu/-Trp
QDO＝Quadruple dropout medium：SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp
baitタンパク質発現用pGBKT7 DNA-BDベクターの選択マーカー：TRP1
preyタンパク質発現用pGADT7 ADベクターの選択マーカー：LEU2

注：現在、ユーザーマニュアルでは、125 ng/ml濃度のAbAを含む培地上で、ライブライースクリーニングを行うことを推奨しています。


図5. 【実験例2】3種類のbait/preyペアを用いたAbA耐性の比較
3種類のbait/prey融合タンパク質ペアをそれぞれ発現するY2HGold酵母株を用いて、各濃度のAbAを含むDDO（SD/-Trp/-Leu）寒天培地上でのコロニー形成能を調べた。各酵母のコロニー形成能はbait/prey融合タンパク質ペア間の相互作用の強度を反映することが分かる。
陰性コントロールペア（BD-POUmOct4+AD-null）、相互作用が推定されるペア（BD-POUmOct4+AD-E2I）、陽性コントロールペア（BD-p53+AD-T-Ag）

Box 1、Box 4：-20℃
Box 2：-70℃
Box 3、Box 5：室温